感觉神经肽P物质对哮喘大鼠气道平滑肌细胞钙离子通道的影响及其机制

Asthma is a chronic inflammatory disease characterized by airway hyper-responsiveness that involves many inflammatory cells and mediators, which can lead to airway smooth muscle contraction. Airway smooth muscle cells (ASMC) are important effector cells in asthma. The responsiveness of smooth muscle to diverse stimuli is controlled by changing the concentration of intracellar caclium ion ([Ca2+]i). Elevation of [Ca2+]i results from increased Ca2+ influx across the plasma membrane following activation of Ca2+ ion channels, and from release of stored Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR). Activation of Ca2+ ion channels is more important than release of stored Ca2+ from the (SR), especially K-Ca channels play an important role in asthmatic airway. Neurokinins (NKs) participate in asthmatic airway inflammation. In the past we verified that NK-1R antagonist downregulates calcium concentration in asthmatic ASMC by increasing Serca2 mRNA and decreasing Ip3r mRNA expression, but the role of Neurokinin on Ca2+ ion channels is unknown; if Neurokinin can also effect on Ca2+ ion channels, which would benefit to asthma treatment, so in our study we want to investigate the effect of Neurokinin on Ca2+ ion channels at cell level in order to find the new method for asthma treatment.

哮喘急性发作时主要表现为气道炎症及高反应性引起ASM痉挛，ASMC在哮喘气道是主要的效应细胞，其对不同刺激的反应是由细胞内钙离子浓度变化来完成的。细胞内钙离子浓度的调节是通过细胞膜钙离子交换通道及肌浆网钙离子储备释放完成的，相对于钙离子储备的释放，钙离子的流入补充尤其重要。感觉神经肽参与哮喘气道炎症及气道高反应性，且感觉神经肽受体是G蛋白受体家族成员，本课题组既往的研究证明感觉神经肽受体拮抗剂可促进ASMC增殖迁移，并通过增加SERCA表达，降低IP3R表达来降低ASMC内钙离子浓度增加肌浆网对钙离子的储备，但其对ASMC细胞膜钙离子通道的影响未见报道。如果感觉神经肽受体拮抗剂既有增加钙离子储备，又有抑制钙离子通道的作用，那么哮喘的治疗将有新的突破点，因此本研究拟在前期研究的基础上，在细胞水平上探讨感觉神经肽对大鼠ASMC细胞膜钙离子通道的影响及其机制，为进一步完善哮喘发病机制奠定基础。

哮喘是由于气道慢性炎症及气道高反应性导致气道平滑肌（ASM）收缩。ASMC在哮喘气道是主要的效应细胞。ASMC对不同刺激的反应是由细胞内钙离子浓度调节的。细胞内钙离子浓度的调节是通过细胞膜钙离子交换通道及肌浆网钙离子储备释放完成的。对于有限的钙离子储备钙离子的流入补充是很重要的。其中K+-Ca2+及Na+-Ca2+离子交换通道参与SMC的收缩、增殖及细胞周期的调节。因此对于ASMC细胞膜离子通道的研究在哮喘治疗上是新的靶点。感觉神经肽及其受体参与哮喘气道炎症及气道高反应性。感觉神经肽是通过其特异性受体发挥其生物活性的。既往的研究证明感觉神经肽受体拮抗剂可促进ASMC增殖迁移，并通过增加SERCA表达，降低IP3R表达来降低ASMC内钙离子浓度。因此本研究在细胞水平上探讨感觉神经肽对大鼠ASMC细胞内钙离子通道的影响及其机制，为进一步完善哮喘发病机制的研究奠定细胞学基础。本研究通过原代培养气道平滑肌细胞；荧光免疫细胞组化识别ASMC；膜片钳技术检测乙酰胆碱（Ach）、感觉神经肽P物质、感觉神经肽P物质受体拮抗剂GR203040(神经激肽1受体，NK-1R)、钙离子拮抗剂（尼莫地平）干预前后ASMC细胞NCX离子电流变化。根据电压、电流变化绘制电压-电流曲线。激光共聚焦显微镜观察ASMC在不同干预因素干预前后细胞形态及收缩的长度的变化，计算各组细胞收缩百分比，对各组ASMC收缩长度百分比进行统计学分析。结果证明P物质增加ASMC内钙离子电流，而NK-1R拮抗剂会减少ASMC内钙离子电流。 P物质会促进反向模式Na+–Ca2 +交换电流增加使细胞内钙离子浓度增加从而导致ASMCs收缩，但电流密度低于ACh。NK-1R拮抗剂降低ASMCs反向模式离子电流活动降低细胞内钙离子浓度，其电流密度类似于NCX抑制剂（KB-R7943），但其并不能松弛平滑肌细胞。从而对于目前临床上有部分哮喘急性发作的患者，经常规应用糖皮质激素类、茶碱类药物等无明显缓解，可尝试其他办法，如本实验中应用神经肽受体拮抗剂可一定程度的缓解气道平滑肌细胞收缩，减轻哮喘急性发作时气道平滑肌痉挛，有助于缓解哮喘发作程度，为将来哮喘患者的治疗打开了新的思路。