活细胞纳米分辨动态功能成像方法研究

Visualization of the traces of related molecules/vesicles and their environments simultaneously will pave a way to observe and analyze dynamic events. As a universal tool of analyzing dynamic events in cells, single particle tracking (SPT) by now, are limited by the depth of focus, so tracking molecules/vesicles moving all around the living cells is still a question, furthermore, those subcellular structural information related to the environments of those dynamic events were always missed. In this project, we proposed a novel imaging approach which can be used to supply the traces of dynamic molecules/vesicles and images of subcellular structures simultaneously. In order to localize moving molecules all around the living cell, with three-dimensional(3D) nano-resolution, polymer quantum-dots will be used as fluorescence labels for those moving molecules, distort grating will be used to extend the depth of field (DOF), and the molecules in the extended DOF will be localized by Bifocal Imaging method, with 3D nano-resolution. In order to image subcellular structures, 2D distort grating will be used to simultaneously acquire series of images from multi-focal-plane in a whole cell. Super-resolution optical fluctuation imaging will be ultilized to reconstruct the final super-resolved image. Analysis Platform for studying dynamic events in living cells with 3D nano-resolution will be built based on this approach, which will bring a powerful tool to scientist in cell studies.

如果可实现细胞内动态过程的可视化，即在活体细胞下获取分子轨迹以及这一过程中的亚细胞结构信息，那么在分子水平上对动态生命过程进行实时观测和分析便成为可能。单粒子追踪（SPT）是分析细胞内动态过程的一种手段，然而，受景深限制，目前SPT方法对整个细胞范围内的多个分子难以实现实时快速高精度追踪，并且单纯的SPT往往缺乏对于动态过程环境的分析。为此，本项目将利用聚合物量子点作为荧光标记，利用弯曲光栅景深扩展功能与双焦面法巧妙结合，发展一种可对大景深范围内多个分子同步进行三维纳米分辨定位追踪的新方法；同时，通过弯曲光栅对完整细胞内多个平面图像并行实现序列成像，利用光学涨落超分辨成像术实现亚细胞结构三维扫描，作为分子运动动态过程环境分析的参考。此基础上建立活细胞动态分析平台将有望成为细胞生物学的重要研究工具。

实现细胞内动态过程的可视化，即在活细胞下获取分子轨迹以及亚细胞结构信息，对于在分子水平上对动态生命过程进行实时观测和分析非常关键。细胞内动态过程相关的目标可以分为两类，一类是运动快速的目标，一类为缓慢运动的目标，他们有着不同的运动特点和成像要求。为此，本项目针对目前细胞内动态功能成像中如何实现全细胞内多个任意位置运动目标同时三维纳米分辨定位这一难题开展研究，提出一种可在完整细胞内并行多粒子追踪的新方法，将单分子三维定位方法与景深拓展的方法相结合，即变形光栅结合双物镜双焦面，称为DDBCM方法。我们进行了理论验证表明，其成像深度范围达到一般细胞厚度，即10微米，x、y、z方向定位精度达到4.5nm、4.3nm、17.1nm；此外，搭建完成的DDBCM系统标定结果显示，10微米深度范围内全局定位精度达到6.4nm，7.1nm，22.4nm。不仅如此，针对运动目标，我们还进一步提出一种包含更多信息的定位追踪方法，称为四维追踪，它不仅可以实时获得运动目标的纳米精度轨迹，还可以对运动过程中运动目标周围的微环境通过荧光寿命这一次参数进行实时监测。我们对这一方法进行了理论论证，x、y、z方向定位精度达到10nm、15nm、33nm,荧光寿命精度达到40ps。我们搭建完成了该四维追踪系统，并实现了活细胞内吞过程相关的四维追踪。此外，对于缓变目标的纳米分辨成像，我们针对单分子定位显微超分辨方法中计算速度慢、时间分辨差的问题，围绕成像速度、计算速度，提出多种算法并进行了实验验证，获得了缓变目标的三维快速纳米分辨成像。提高计算速度方面，构建了三维多测量矢量压缩传感模型，然后采用多稀疏贝叶斯学习算法求解，实现三维单分子定位，得到细胞微管结构的纳米分辨荧光图像；提出一种快速超分辨率成像的频域压缩传感（FD-CS）技术。提高成像速度方面，针对密集分子图像，提出基于增强拉格朗日方法的图像重建算法以减少成像画幅数；提出一种准确快速的重建算法（DRL-STORM）以改进高密度超分辨率显微镜中的时间分辨率，实现了0.5s时间分辨的纳米分辨细胞成像。