基于轴向选择性激发和单分子定位的荧光三维纳米成像术研究

近年来发表在Nature或Science上基于荧光分子开关效应和分子定位的纳米分辨成像方法尽管横向和轴向分辨率已突破了衍射极限，但其轴向成像深度即使在最有利的斜入射照明情况下，也只有3微米，远不能满足活体细胞纳米分辨三维成像的要求。产生这一问题的原因是，如果样品更厚，非焦平面中on态荧光分子带来的串扰，将使得焦平面上荧光分子产生的图像信息完全被背景噪声淹没。针对这一瓶颈问题，本项目创造性的利用荧光分子开和关的速率与激活光及去激活光的光强成正比这一特点，提出采用空间非相干激活光和去激活光的干涉照明,来实现样品轴向选择性激发，即使得只有单个超薄层的荧光分子稀疏激发，来有效地抑制非焦平面on态荧光分子产生的背景噪声。在轴向选择性激发大幅度消除背景噪声的前提下，再结合分子定位和双焦平面探测，可使横向和轴向空间分辨率达20-30纳米，且成像深度大于一般细胞厚度，从而有望实现完整细胞三维纳米成像。

基于质心定位和稀疏激发的单分子定位法（例如STORM, PALM, FPALM）由于具备了单分子的分辨率，是细胞纳米分辨成像的理想工具。本项目围绕完整细胞的三维纳米分辨展开研究，通过柱面镜像散法实现三维纳米分辨，并在此基础上搭建了适用于完整细胞的三维纳米分辨成像系统，系统的定位定位精度经测试，达到了4.11nm（x）、3.8 nm（y）、8.2nm（z）。在系统中，为了提高系统的稳定性，我们研制了一套实时焦点轴向防漂移装置对原成像系统进行辅助，防漂移精度达到10nm（标准差，STD），与商用（例如Nikon和Olympus）防漂移系统相比，精度提高约1个量级。在上述基础上，我们在实现了完整细胞的三维纳米分辨成像，单个微管直径测试结果显示为65.5nm。在完成本课题研究目标的同时，我们还在活细胞纳米成像上进行了有意义的探索，取得了一些研究成果。例如，我们对具有较大景深的双螺旋点扩展函数（DH-PSF）三维纳米定位法的极限定位精度进行了分析；我们研究了进一步扩展景深的三维纳米定位方法，提出一种具有大景深条件下多目标并行追踪的方法，DDCM；我们研制了DDCM的关键器件；我们搭建了DDCM系统，进行了初步的验证实验。活细胞条件下的纳米分辨是目前的纳米分辨进一步发展应用的瓶颈问题，但同时也是必然发展方向。我们所开展这些工作作为本课题工作的拓展，为将来我们将纳米分辨从本课题中提到的“完整细胞”拓展到“活细胞”鉴定了基础。