活细胞超高分辨SIMBA成像探针和方法研究

Super-resolution (SR) imaging technologies enable us to define the accurate localization of labeled protein in cells and have been hot issues in recent years in popular imaging field. However, because the current SR methods either require sophisticated optical setups, specific fluorescent probes and deep experts or have difficulties to achieve high spatial and temporal resolutions simultaneously, the applications of live-cell SR microscopy have remained technically challenging. Based on our recently developed live-cell SIMBA microscopy, we will develop several novel SR techniques including: quick-SIMBA with higher temporal-spatial resolution, dual color SIMBA technique, PPI-SIMBA for detecting protein-protein interaction and the single molecular tracking-SIMBA technique. The novel SR techniques in this project will greatly increase the development of live-cell SR microscopies and their applications in the process of protein trafficking, transcription, and translation.

超高分辨成像技术使我们可以在纳米尺度观察目标蛋白在细胞中的精确定位，是蛋白质研究和荧光成像领域国际前沿的研究热点和发展趋势。然而，受限于复杂的成像设备、荧光探针以及难以同时具有高的时间和空间分辨率，活细胞超高分辨成像技术仍面临诸多挑战。本课题将基于前期自主研发的基于单分子定位的贝叶斯成像方法SIMBA，发展多种新型活细胞超高分辨成像技术及其对应的荧光蛋白探针，并拓展它们在细胞内膜动态结构观察等生物学中的应用。具体包括发展更高时空分辨率成像技术qSIMBA，双色活细胞成像技术dSIMBA，超高时空分辨率蛋白质-蛋白质相关作用成像技术PPI-SIMBA，以及单分子跟踪超高分辨成像技术smtSIMBA。本项目的实施将极大地促进当前活细胞超高分辨成像技术的发展及其在蛋白质定位和转运研究、蛋白质转录和翻译等诸多领域中的广泛应用。

针对当前活细胞超分辨成像技术面临的诸多挑战，本项目基于前期自主研发的探针和SIMBA超分辨成像方法，发展了两种超分辨成像方法以及四种亟须的荧光探针。具体包括：1）发展了快速单分子引导的贝叶斯算法Quick-SIMBA，获得0.25 s,50 nm的时空分辨率；2）发展海森（Hessian）单分子定位超高分辨成像方法能够有效去除sCMOS像素依赖的读出噪声，明显降低因噪声产生的重构伪迹，提高超分辨成像技术的时空分辨率；3）发展了具有亮度高，抗锇酸特性优良的荧光蛋白探针mEosEM，是第一个报道的用疏水性树脂Epon包埋后依然保留了较强的荧光信号的探针；4）发展了高亮度、快速成熟探针PcStar，可用于观察果蝇胚胎早期发育过程；5）开发展了新的红色pH敏感型荧光蛋白pHmScarlet，可同时检测囊泡分泌和融合；6）发展了基于内参蛋白荧光强度比值的新型钙探针，用于实时检测活细胞中内质网钙库和局部钙微区的动态变化。.另外，我们还利用标记和成像技术进行功能研究，研究了内质网跨膜蛋白拓扑结构以及EI24调控自噬发生的分子机制。此外，我们还对当前荧光蛋白标记以及超高分辨显微成像技术进行了总结。 .本项目的成果将极大地促进当前超高分辨显微成像技术的发展及其在细胞生物学中的广泛应用。