药用右旋糖酐生物合成中的右旋糖酐蔗糖酶催化机理及其分子改造研究

Dextransucrase is a key enzyme in medicinal dextran biosynthesis during the fermentation of Leuconostoc mesenteroides. The enzyme catalyzes the synthesis of dextran with D-glucosyl moieties from sucrose. Though dextransucrase plays a significant role in many fields such as medicinal polysaccharide synthesis, pharmaceutic adjuvant and functional oligosaccharides preparation, the catalysis mechanism is still unclear. This project aims to begin with the obtained dextransucrase and its gene (dexYG). To clarify the catalysis mechanism further, the glucan chain elongation and branching occurrence mechanism as well as the rules of receptor reaction in catalytic process will be explored. In order to improve the thermal stability and activity of dextransucrase, several methods of molecular modification will be carried out involving the detruncation of terminal amino acid residues, the introduction of disulfide linkages based on the mechanism mentioned above. And this research will provide the theoretical foundations for controllable medicinal polysaccharide biosynthesis and the expanding of catalytical applications in dextransucrase domain.

右旋糖酐蔗糖酶是肠膜状明串珠菌发酵合成药用右旋糖酐的关键酶，该酶以蔗糖为底物，将蔗糖分子中D-葡萄糖基进行聚合生成右旋糖酐,其在多糖类药物合成、药用辅料和功能低聚糖的制备等领域均有重要应用，但其催化机理尚未明晰。本项目拟从已获取的右旋糖酐蔗糖酶及其基因（dexYG）入手，通过研究右旋糖酐蔗糖酶催化过程中的糖主链增长机制、支链形成机制及受体反应规律，阐明该酶的催化机理；在此基础上通过末端氨基酸残基截短和二硫键的引入等手段对该酶进行分子改造，探索酶的分子进化，以获得耐热性好、催化活性高的右旋糖酐蔗糖酶。本课题的实施将极大地提升对右旋糖酐蔗糖酶的理论认识，为多糖类药物生物合成及拓宽该酶的催化应用提供理论依据。

右旋糖酐蔗糖酶是肠膜状明串珠菌发酵合成药用右旋糖酐的关键酶，该酶以蔗糖为底物，将蔗糖分子中D-葡萄糖基进行聚合生成右旋糖酐,其在多糖类药物合成、药用辅料和功能低聚糖的制备等领域均有重要应用，但其催化机理尚未明晰。本项目从已获取的右旋糖酐蔗糖酶及其基因（dexYG）入手，通过研究右旋糖酐蔗糖酶催化过程中的糖主链增长机制、支链形成机制及受体反应规律，阐明了该酶的分子机制；在此基础上通过定点突变和二硫键的引入等手段对该酶进行分子改造，探索酶的分子进化，获得耐热性好、催化活性高的右旋糖酐蔗糖酶。.通过对右旋糖酐蔗糖酶分子截短的研究，发现结构域A与产物糖苷键形成有很大的关系，结构域V与酶催化产物葡聚糖主链增长有关，结构域Ⅳ的截短突变株在合适的受体分子下，表现出了良好的转糖基活力。研究结果获取高枝化的突变右旋糖酐蔗糖酶，其催化产物的5%（α1-3）提高到了17%，同时获得耐热性好、催化活性高的正突变右旋糖酐蔗糖酶P473S/P856S，与野生型相比，突变酶P473S/P856的酶活性增加2.86倍，其耐热性在35 ℃下的半衰期（T1/2）增加了7.4倍，催化效率（kcat/Km）提高了近2倍。该酶的受体反应以麦芽糖为最佳受体，三糖、四糖依次减弱，受体反应主要是转移到一个或两个葡萄糖基到受体分子上，生成聚合度较低的低聚糖。通过右旋糖酐蔗糖酶咖啡酸苯乙酯（CAPE）的受体反应，成功分离纯化得到了两种CAPE的糖苷纯品并解析了两种新型化合物的结构。 研究结果表明G-CAPE和2G-CAPE的水溶性有明显改善，分别是CAPE的35和90倍。G-CAPE比CAPE和2G-CAPE发挥出了更强的抗炎作用，此外G-CAPE还具有较低的细胞毒性，显示出很好的炎症性疾病治疗潜力，为进一步开发预防慢性炎症性疾病的新药打下基础。研究说明右旋糖酐蔗糖酶酶促糖基化可用于改善天然生物活性化合物的生物活性和物理化学性质。.研究结果对于提升对右旋糖酐蔗糖酶的理论认识、利用该酶可控催化合成多糖类药物、提高其应用价值具有重要意义。