氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶的分子生物学基础和催化功能研究

右旋糖酐因安全、无毒、生物相容性好，被广泛应用于医药、食品等多个领域。氧化葡萄糖杆菌（G.oxydans）右旋糖酐因其特有的粘度较低、含热值较低的优点更加受到关注。申请者已从G.oxydans中克隆了右旋糖酐糊精酶（DDase）基因，并在大肠杆菌中成功表达，确定了His-661、Asp-437、Arg-513、Lys-350等影响催化功能的关键残基。在此基础上申请者拟通过揭示DDase表达调控机制，构建高效表达菌株，分离纯化DDase，并对其酶学性质和催化反应机理进行深入分析。进一步结合糖基转移酶家族其它右旋糖酐酶催化机理的研究报道，利用功能域替换等技术以报道的右旋糖酐酶关键区域替换DDase的适当位点，对其进行理性设计改造，获得性能优良的新型DDase，实现对不同结构和性能右旋糖酐的理性调控，为最终实现右旋糖酐工业化生产技术的升级、改善产物的分子量分布以及提高产品质量与产率提供理论依据。

右旋糖酐是一种由若干葡萄糖脱水形成的高分子聚合物，是世界上第一个工业化生产的微生物多糖，因安全、无毒、生物相容性好，被广泛应用与在医药、食品等多个领域。氧化葡萄糖杆菌（G. oxydans）右旋糖酐因其特有的粘度较低、含热值较低的优点更加备受关注。本项目以氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶为研究对象，通过建立表达调控策略，诱导胞内右旋糖酐糊精酶高表达。应用蛋白纯化技术获得了电泳纯的新型右旋糖酐糊精酶，并对其酶学性质进行了研究。通过对以麦芽糊精为底物、以G. oxydans右旋糖酐糊精酶为催化剂合成的新型右旋糖酐进行结构解析研究了新型右旋糖酐糊精酶的催化功能。同时对获得的新型糖基转移酶进行了催化功能和催化机理的初步研究。.对氧化葡萄糖杆菌合成右旋糖酐糊精酶的产酶的关键调控因素进行了筛选和优化，最终确定了最优的调控因素和浓度，酶活由初始的0.04 U/mL提高到0.24 U/mL，达到目前文献报道的最大值。为进一步提高氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶的产量，在3 L发酵罐水平上考察了pH对菌体生长和产酶的调控作用。基于不同pH发酵过程中菌体生长及产物合成的变化，确定了pH两阶段表达调控策略，发酵液中右旋糖酐糊精酶单位体积酶活提高到4.03 U/mL。.联合应用离子交换层析和凝胶过滤层析法纯化得到了电泳纯的右旋糖酐糊精酶，同时考察了其主要的酶学特性：分子量，62 kD；最适温度，35 °C；最适pH，pH 6.3。这些性质均与已报道的氧化葡萄糖杆菌ATCC 11894右旋糖酐糊精酶存在较大差异，证明其是一种新的酶源。.研究了氧化葡萄糖杆菌利用麦芽糊精合成右旋糖酐的过程并对产物结构进行了分析，进一步揭示了右旋糖酐糊精酶的催化功能。凝胶渗透色谱分析表明产物的分子量为96.8 kDa，产物结构分析表明右旋糖酐仅仅是由葡萄糖单元聚合而成的，其非还原端葡萄糖单元：6位连接葡萄糖单元：4,6位连接葡萄糖单元=8.62：78.79：12.59。表明产物右旋糖酐中主链为α-1,6-糖苷键，同时少量的α-1,4-糖苷键仅出现在支链中。该结构与已报道的右旋糖酐均存在一定差异，是一种新型右旋糖酐。.应用分子克隆技术表达了预测的葡萄糖基转移酶基因PGUG_05731。酶活性分析发现，PGUG_05731酶是一种麦芽糊精葡萄糖基转移酶，并结合同源建模、分子对接和动力学模拟初步揭示了其催化机理。