条锈菌效应蛋白转运机制及其功能分析

Stripe rust, caused by Puccinia striiformis Westend. f. sp. tritici Eriks (Pst), is one of the most serious diseases with wide coverage and high frequency in China, and affects the wheat safe production tremendously. Much attention has been paid to the disease research worldwide because of its great ecnomic significance. Due to the special features of Pst like biotrophic pathogens and its fast virulence variation, the pathogenesis of this pathogen is largely unknown. Thus, the disease has been constantly threatening the wheat production and food security. Previous studies indicate that plant pathogenic fungi secrete effector proteins into host cell to manipulate host defenses for successful infection.Therefore, in this study, we predict the Pst secretome with compative genomics based on our Pst genome project. The haustoria specificly expressed secred protein genes will be obtained by compative analysis of transcriptomes of uredinospores, germ tube and haustoria. Then we will characterize theses secretd proteins using transient expression in tobacco, and the candidate effectors will be further analyzed. Besides, we will predict the conserved motifs of the candidate effectors with bioinformatic methods and identify the corresponding motifs responsible for the translocation or the virulence activity with gene mutation method. Finally, we will analyze the translocation pattern and the opposite target proteins of effectors. This project will support a good foundation for revealing the functional mechanism of effectors in Pst-host plant interactions more profoundly and offer an important theoritical basis for elucidating the pathogenesis mechanism of Pst.

小麦条锈病发生范围广，成灾频率高，危害严重，是影响我国小麦安全生产的重要生物灾害。鉴于该病害具有重要的经济影响，其防治研究在国际上一直受到高度重视。但由于该病害病原菌具有专性寄生、毒性变异快等特点，目前对病菌致病机制尚缺乏深入了解，导致该病害仍在不断威胁着小麦生产和粮食安全。研究表明，病原菌在侵染寄主时会向寄主细胞内释放效应蛋白，通过调控寄主防御机制发挥毒性功能。因此，本项目拟在实验室已完成的条锈菌全基因组测序基础上，预测其分泌蛋白组；并通过比较分析夏孢子、芽管和吸器的全转录组，获得条锈菌吸器特异表达的分泌蛋白；然后利用烟草瞬时表达系统筛选并鉴定出目标效应蛋白；通过生物信息学和序列定点突变技术鉴定效应蛋白的保守基序，并在烟草和小麦中解析效应蛋白转运机制及与其互作的病菌或寄主基因的功能。研究结果将为深入揭示效应蛋白在病原菌-寄主互作中的作用机理奠定基础，进而为解析条锈菌致病机制提供理论依据。

小麦条锈病是我国小麦生产上的重大生物灾害。病菌变异导致的品种抗性丧失是条锈病频繁流行成灾的根本原因。由于对病菌致病性及其变异机理缺乏深入认识，导致该病害一直在威胁着小麦的生产安全。研究报道，病原菌在侵染寄主时会向寄主细胞内释放效应蛋白，通过调控寄主防御机制发挥毒性功能。因而，鉴定条锈菌效应蛋白，解析其转运方式，揭示其调控机理对开发新的条锈病防控策略具有重要意义。. 为此，本项目通过比较分析条锈菌吸器，夏孢子、芽管的全转录组，获得吸器特异诱导表达的分泌蛋白组，通过瞬时表达筛选鉴定到6个能够抑制由BAX和INF1诱导的细胞坏死的候选效应蛋白；通过亚细胞定位与大豆根尖吸收实验，证实6个效应蛋白可转运到植物细胞内。通过序列缺失突变分析，表明负责转运的结构域位于N-末端，且含有Y/F/WxC基序，但Y/F/WxC基序对条锈菌效应蛋白的转运并不是必须的；借助细菌三型分泌系统，将6个效应蛋白导入小麦，均能够抑制小麦胼胝质的积累，以及小麦抗病反应中活性氧的积累与过敏性坏死反应的发生，表明其具有抑制寄主免疫反应的毒性功能。同时，发现效应蛋白Pst_4941 和Pst_5578在小麦近等基因系Yr1 NIL和Yr7 NIL中能激发HR反应，具有潜在无毒性功能；通过寄主诱导的病菌基因沉默（HIGS），发现Pst_4941 和Pst_5578的沉默，导致条锈菌吸器形成、菌丝生长受到抑制，病菌致病显著降低，寄主抗病性明显增强；酵母双杂交与双分子荧光证实，Pst_5578和Pst_4941均能与小麦去甲基化酶TaPKDM7和硫氧还蛋白TaTrx-m4互作，Pst_5578还可以与小麦脱水蛋白TaDHN-1互作。靶标基因的沉默能够增强小麦的抗病性，推测它们可能通过调控小麦的细胞坏死、防御相关基因表达及茉莉酸通路等影响小麦抗病性。本项目研究结果系统解析了条锈菌效应蛋白在条锈菌侵染小麦过程中的作用位点、转运方式、功能及作用通路，为深入揭示条锈菌的致病机制奠定了基础，同时，为利用效应蛋白创制新型抗病材料提供了资源和理论依据。