热休克蛋白90巯基亚硝基化修饰在动脉粥样硬化内皮损伤中的作用研究

Vascular endothelial dysfunction is a significant initiating factor of atherosclerosis (AS). Chaperone protein Hsp90 participates in the maturation and activation of many proteins. Hsp90 is modified by S-nitrosylation but whether it participates in atherosclerosis induced endothelial injury remains unknown. Prior experiments have showed that oxLDL increased the level of Hsp90 S-nitrosylation and iNOS in endothelial cells, the potential modification site of which identified to be cysteine 529 combining a tandem affinity purification approach and mass spectrometry. Mutation of Cys529 reversed the effect of oxLDL on the increasing of Hsp90 S-nitrosylation and binding of Hsp90 to AHA1. Therefore, combining site-directed cysteine mutagenesis, we aim to test the hypothesis that AS-related damaging factors regulate Hsp90 S-nitrosylation by affecting the level of iNOS, and Hsp90 S-nitrosylation influence its binding to AHA1 and Cdc37 resulting in signaling pathway alternation in vivo and vitro. This research would hopefully uncover the novel mechanism of atherosclerosis and provide new targets for preventing vascular endothelial cell injuring-related diseases.

内皮损伤是动脉粥样硬化（AS）的重要始动因素,其发病机制未全阐明。热休克蛋白90(Hsp90) 作为分子伴侣参与众多蛋白的成熟与激活。研究表明Hsp90可发生巯基亚硝基化修饰,但该修饰是否参与AS内皮损伤尚不明确。预实验结果显示oxLDL可增加内皮细胞Hsp90巯基亚硝基化修饰及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平，串联质谱技术检测修饰位点可能为半胱氨酸529（Cys529），Cys529位点突变后，oxLDL增加Hsp90巯基亚硝基化水平及降低Hsp90与AHA1结合的作用消失。因此，本项目拟在离体细胞及整体动物水平，联合特定半胱氨酸位点突变，验证科学假说：致AS内皮损伤因素可通过影响iNOS水平调节Hsp90半胱氨酸位点的巯基亚硝基化修饰，改变其与AHA1、Cdc37的结合来调控相关信号通路，参与AS内皮损伤。可望揭示AS新机制，为内皮损伤相关疾病的防治提供新的干预靶点和思路。

内皮功能障碍是动脉粥样硬化的初始过程。热休克蛋白90作为一种分子伴侣，在多种心血管疾病中发挥着至关重要的作用。Hsp90的功能受S-亚硝基化(S-nitrosylation, SNO)调控。然而，SNO-Hsp90在动脉粥样硬化内皮功能障碍中的确切作用尚不清楚。SNO-Hsp90在人的动脉粥样硬化和啮齿类动物的主动脉以及经氧化低密度脂蛋白（oxLDL）处理的内皮细胞中显著升高。抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）或转染Hsp90半胱氨酸521（Cys521）突变质粒均可降低oxLDL处理的内皮细胞中SNO-Hsp90的水平。免疫共沉淀和邻位连接实验表明，Cys521位点SNO-Hsp90抑制了Hsp90与Hsp90 ATP酶活性激活因子1（AHA1）的相互作用，但促进了Hsp90与细胞分裂周期37（CDC37）的结合。Hsp90 Cys521突变增加内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性，抑制核因子κB（NF-κB）信号通路，从而增加一氧化氮（NO）的生物利用度，减轻oxLDL处理的内皮细胞的内皮黏附、炎症和氧化应激。此外，在高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠中，给予Cys521突变Hsp90的内皮特异性腺相关病毒显著减轻血管氧化应激，巨噬细胞浸润和动脉粥样硬化病变面积。总之，位于Cys521的SNO-Hsp90作为构象开关，破坏了Hsp90/AHA1的相互作用，但促进了CDC37的募集，从而加剧动脉粥样硬化。