CTSB的巯基亚硝基化修饰在AngII诱导的血管内皮细胞损伤中的作用研究

Angiotensin II (Ang II)-induced vascular endothelial cells injury plays a key role in several vascular diseases. In our study, cathepsin B (CTSB) was identified to be S-nitrosylated at Cys319 site by using biotin-switch and mass spectrometry assays. CTSB is involved in regulating inflammatory response and cell apoptosis. Our prior experiments found that the levels of iNOS (inducible nitric oxide synthase) and S-nitrosylated CTSB were increased in Ang II-induced vascular endothelial cells injury. Moreover, the S-nitrosylated CTSB contributed to the inflammasome activation. Therefore, we plan to use specific cysteine mutation, gene overexpression and knockdown to identify the effects of S-nitrosylated CTSB on Ang II-induced vascular endothelial cells injury.

血管紧张素II（Ang II）诱导的血管内皮损伤是多种血管疾病发生发展的关键调控因素。本项目前期研究通过生物素转化法（biotin-switch）结合蛋白质谱技术发现组织蛋白酶B（CTSB）能够发生巯基亚硝基化修饰且修饰位点为319位半胱氨酸（Cys319）。CTSB在调节细胞炎症反应和凋亡中具有重要作用。本项目前期研究结果显示在Ang II诱导的血管内皮细胞损伤模型中，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达水平上调，CTSB的巯基亚硝基化修饰增加并刺激炎症小体活化。本项目拟通过CTSB修饰位点突变的腺相关病毒、基因过表达或敲低等方法，明确CTSB的巯基亚硝基化修饰在Ang II诱导的血管内皮细胞损伤中的作用机制。

组织蛋白酶B（CTSB）是溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族成员。我们发现CTSB的巯基亚硝基化修饰能够增加其自身蛋白水平。考虑到影响蛋白表达水平有合成和降解两方面因素，我们分别在给予蛋白酶体抑制剂MG132或蛋白合成抑制剂放线菌酮的情况下，检测巯基亚硝基化修饰对CTSB蛋白表达的影响。结果显示，给予CHX刺激后，CTSB蛋白表达水平不再上调，表明CTSB巯基亚硝基化修饰是通过调节CTSB蛋白合成来影响CTSB的蛋白水平。此外，qPCR检测到表达野生型CTSB的内皮细胞在致损伤因素处理后，CTSB的mRNA水平升高，提示CTSB的巯基亚硝基化修饰能够影响其 mRNA水平。然而，荧光素酶报告基因显示致损伤因素处理并没有上调其CTSB启动子的活性。接下来我们研究了放线菌素D处理后不同时间点的CTSB mRNA水平从而判断其RNA降解情况。结果证实致损伤因素处理下，相比于CTSB修饰位点突变的内皮细胞，表达野生型CTSB的内皮细胞中其mRNA的降解速度下降。这些结果表明，CTSB的巯基亚硝基化修饰通过维持mRNA的稳定性来上调其蛋白表达。我们进一步研究了CTSB的巯基亚硝基化修饰如何影响其mRNA的稳定性。我们发现敲低内皮细胞中ADAR1后可降低CTSB的蛋白表达，说明ADAR1介导的RNA编辑参与影响了CTSB mRNA的稳定性。结果显示CTSB RNA编辑使RNA结合蛋白HuR被招募到CTSB mRNA的3′UTR上，从而增加CTSB mRNA的稳定性， 增加CTSB的蛋白表达水平。在致内皮损伤因素处理下，CTSB蛋白的巯基亚硝基化修饰引起的CTSB RNA编辑，使RNA结合蛋白HuR结合到CTSB mRNA3′UTR，从而增加CTSB mRNA的稳定性，上调CTSB的蛋白表达。