热休克蛋白90巯基亚硝基化修饰在心肌纤维化中的作用及机制研究

Cardiac fibrosis is a fundamental constituent of most cardiac pathologies and represents the upshot of nearly all types of cardiac injury. Cardiac fibrosis is the main pathological characteristics of myocardial remodeling, while the mechanism of cardiac fibrosis is still not fully elucidated. Heat shock protein 90（Hsp90）is highly conserved chaperone that is responsible for the maturation and activity of a variety of signaling protein. It has been reported that Hsp90 can be S-nitrosylated. Whether the S-nitrosylation of Hsp90 mediates myocardial hypertrophy remains unclearly. Our preliminary experiments have confirmed that S-nitrosylation of Hsp90 were significantly upregulated in angiotensin II-treated cardiac fibroblasts and myocardial tissues isolated from mice 4 weeks after transverse aortic constriction, meanwhile, the protein level of inducible nitric oxide synthase (iNOS) was upregulated. In addition, angiotensin II increased Hsp90/TβRII interaction in cardiac fibroblasts. These data suggested that Hsp90 S-nitrosylation may play an important role in myocardial hypertrophy. Therefore, the aim of the project is to validate the hypothesis: iNOS-mediated Hsp90 S-nitrosylation may influence Hsp90/TβRII interaction, then activate TGF-β1/Smads signal pathway to participate in the process of cardiac fibrosis in vivo and in vitro. The significance of our research is to discover the novel mechanism of cardiac fibrosis and provide more unambiguous therapeutic targets for prevention or treatment of cardiovascular diseases.

心肌纤维化是心肌重构的主要病理变化之一，其发病机制未完全阐明。热休克蛋白90（Hsp90）作为分子伴侣对众多蛋白的构象成熟和功能稳定进行调控。研究表明Hsp90可发生巯基亚硝基化修饰，但该修饰是否参与心肌纤维化尚无报道。我们的预实验结果显示在血管紧张素II处理的心肌成纤维细胞及主动脉缩窄术后小鼠的心肌组织中Hsp90的巯基亚硝基化水平明显增高，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达增加，同时血管紧张素II也可增加心肌成纤维细胞内Hsp90与TβRII的结合。因此，本项目拟在离体细胞及整体动物上，联合特定半胱氨酸位点突变、基因敲除、过表达等方法，验证科学假说：致心肌纤维化因素可通过上调iNOS调节Hsp90半胱氨酸的巯基亚硝基化修饰，增加Hsp90与TβRII的结合、激活TGF-β1/Smads信号通路，促进心肌纤维化。本项目可望揭示心肌纤维化新机制，为心肌纤维化的防治提供新的干预靶点和思路。

心肌纤维化是一个重要的全球性健康问题，几乎与所有形式的心脏病有关。心肌纤维化是指在心肌间质中胶原纤维过量积聚、各型胶原比例失调以及排列紊乱，进而使得整个心肌组织发生形态、功能上的改变，是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，但目前其发病机制尚未明确，防治手段有限。热休克蛋白90（HSP90）作为分子伴侣对细胞中众多蛋白的构象成熟和功能稳定进行调控，多项研究表明翻译后修饰可影响HSP90的分子伴侣样功能。蛋白质巯基亚硝基化修饰是一种新的蛋白质翻译后修饰，可影响靶蛋白的生物学功能、亚细胞空间定位、蛋白间相互作用从而参与多种病理生理学效应。研究显示HSP90可以发生巯基亚硝基化修饰，但此修饰能否参与疾病的发生发展尚不明确。本研究从人体临床样本、心肌纤维化动物模型、血管紧张素II和异丙肾上腺素诱导的心肌成纤维细胞纤维化细胞模型上，联合串联质谱、特异性修饰位点突变、基因敲除等方法，探讨HSP90巯基亚硝基化修饰对心肌纤维化的影响及分子机理。结果发现致心肌纤维化因素通过上调iNOS的表达，促进HSP90第589位半胱氨酸位点发生巯基亚硝基化修饰，增加HSP90与TGFβ RII的结合、SMAD3的磷酸化及核转位，进而促进心肌纤维化病变。通过敲除或使用1400W抑制iNOS的表达和活性，或通过给予成纤维细胞特异性的修饰位点突变的HSP90质粒/腺相关病毒可抑制TGF-β/Smads3信号通路，从而改善心肌纤维化。此外心肌纤维化时也常伴发心肌细胞肥大，我们研究发现，在心肌细胞上，致心肌肥大因素可通过下调亚硝基谷胱甘肽还原酶的表达，增加HSP90巯基亚硝基化修饰，从而促进HSP90与GSK3β的结合，影响GSK3β及下游eIF2Bε的磷酸化水平，增加心肌细胞面积，上调肥大基因ANP和BNP表达来促进心肌肥厚。本项目揭示了心肌纤维化和心肌细胞肥大发生新机制，可望为相关心血管疾病的防治提供新的干预靶点和思路，具有崭新的理论价值和潜在的应用价值。