新颖噬菌体转录体系的解析及应用

The single-subunit RNA polymerase based transcription system of bacteriophages from Podoviridae family is the prototype for the studies of transcription. It also provided the exclusive enzymatic tool for in vitro RNA synthesis, a cornerstone of the RNA research field. However, based on the limited podoviruses previously known, only a few transcription systems from T7-like phages had been characterized. Recently blooming genome sequencing has revealed a huge diversity within the Podoviridae family. A group of marine cyanophages represented by Syn5 and another group of phages including KP34 that infect many pathogenic bacteria possess distinct transcription systems not predictable by bioinformatic analysis. Based on our successful initial characterization of Syn5 RNA polymerase, this project is aiming for the complete biochemical characterization of the Syn5 and KP34 transcription systems, including their core RNA polymerases, promoters and terminators, key elements in catalysis, and possible transcriptional regulation. The results will fulfill a whole picture of podovirus transcription; improve the understanding on the metabolism of these two important bacteriophages relevant to ecology and human diseases; and more importantly, by optimization, comparison and engineering of these novel phage transcription systems, it is expected to generate novel enzymatic tools for in vitro RNA synthesis.

当前，以短尾噬菌体特有的单亚基RNA聚合酶为核心的转录体系是研究转录机理的基础模型，其高效简洁的转录系统衍生了唯一的RNA体外酶学合成工具，是整个RNA研究领域的重要基石。然而受限于对短尾噬菌体资源的认识，目前被详细研究的仅有来自于类T7噬菌体的单亚基RNA聚合酶转录体系。近年高速发展的基因测序技术揭示了另两类短尾噬菌体：以Syn5为代表的海洋蓝细菌噬菌体和以KP34为代表的众多致病菌的噬菌体。生物信息学分析表明，它们有着与类T7噬菌体迥异的转录系统。为此，本研究将在对Syn5转录体系初步探索的基础上，对Syn5和KP34的两类转录系统进行详尽生化解析，确定其RNA聚合酶基因、启动及终止序列、酶活性位点和可能的调控机制，以促进对这两类与地球生态和人类疾病密切相关的短尾噬菌体的生理代谢的深入认识。同时，通过对这两类转录体系的体外优化和改造，将可能产生新的RNA体外合成工具酶。

RNA是生命中心法则的核心大分子，也是当前生物医药和生物技术的热门大分子。高效精准的RNA体外合成是RNA相关研究和应用的基础和前提。化学合成只能和成小RNA，长链RNA只能通过酶法体外转录合成，而当前RNA体外合成技术的最大瓶颈就是合成工具酶的匮乏，来自大肠杆菌噬菌体T7的单亚基RNA聚合酶已垄断RNA体外合成技术40多年。本项目以应用为导向，利用新近发掘的环境噬菌体分子水平的多样性，通过生物信息学分析及生化酶学方法从中发现并开发新颖强力的RNA合成工具酶以提高长链RNA体外合成技术。本项目完成后，在当前全世界使用的垄断工具酶T7 RNA聚合酶和团队前期研发的Syn5 RNA聚合酶基础上，为长链RNA体外合成工具盒添加了两种各具特点的原创RNA合成工具酶：.（1）KP34 RNA聚合酶：来自分类与T7类亲缘关系较远的一类新测序的phiKMV类噬菌体中首个被鉴定的单亚基RNA聚合酶，其功能特点是识别两类互不相关的转录启动子，其应用优势在于合成末端富含二级机构的RNA时不会像T7 RNA聚合酶一样产生大量非特异性末端延伸，RNA末端精确性提高40倍，因此适用于合成该类RNA例如常用的基因编辑向导RNA（sgRNA）。.（2）VSW-3 RNA聚合酶：克隆于新发现的云南纳帕海高原冰湖噬菌体，能够在低至4摄氏度条件下合成RNA，极大减少了RNA在常温或高温条件下合成过程中的降解，低温合成也可以摆脱对昂贵的合成添加剂-RNA酶抑制剂的依赖，显著降低RNA大规模生产的成本。最大优势是不含T7 RNA聚合酶产物中普遍存在的双链RNA（dsRNA）副产物，dsRNA可引发严重的细胞毒性，因此VSW-3 RNA聚合酶对当前热门的mRNA药物、mRNA疫苗等研究与产业意义重大。目前该酶及其RNA产品已在多家实验室和RNA药物企业得到应用。