深海热液噬菌体NrS-1 DNA聚合酶的功能、结构与应用研究

In this study we will carry out extensive functional and structural investigation on the recently discovered DNA polymerase from deep-sea vent phage NrS-1, including measurements of its catalytic efficiency, thermostability, accuracy, processivity and fidelity, etc., as well as obtaining and analysis of the structures of its catalytic domain and full-length enzyme in their various catalytic status. The application of NrS-1 DNA polymerase in DNA sequencing and synthesis of modified nucleic acids will be tested and optimized. Considering the unique property of NrS-1 DNA polymerase to synthesize DNA de novo in the absence of any primer, this project will improve the understanding of polymerase evolution and mechanism, and may generate original enzymatic reagents from China.

本项目将对近期发现的深海热液噬菌体NrS-1的DNA聚合酶进行深入的功能和结构研究，测定其催化速率、热稳定性、保真性、延伸性、底物专一性等基本功能特性，获得其催化结构域及全长酶在不同催化状态的晶体结构，在此基础上探索其在DNA测序和修饰核酸合成中的应用。鉴于NrS-1 DNA聚合酶合成DNA无需引物的独特性质，该研究将促进对核酸聚合酶的进化和机制的认识，并可期产出中国原创的核酸工具酶。

引发聚合酶属于真核-古菌引发酶超家族，同时具有引发酶和DNA聚合酶活性。本项目研究目标是课题组原创发现的来自深海病毒NrS-1的代表性引发聚合酶。通过本项目的研究我们解析了NrS-1聚合酶催化结构域的晶体结构并通过详尽的结构与生化研究发现了NrS-1聚合酶多个催化关键位点，其中一个特色环状肽段取代了真核-古菌引发酶超家族保守的锌指结构。在NrS-1聚合酶催化域结构中的一个与引发酶识别位点及起始合成相关的螺旋簇结构域与其它真核-古菌引发酶相应保守结构相比相对灵活，这与酶活性实验中发现的NrS-1聚合酶可识别不同的DNA序列起始合成相一致。本研究的一个重要发现是该螺旋簇结构域的突变虽然降低了NrS-1聚合酶的引发活性，却显著增强了其DNA聚合活性。NrS-1聚合酶引发和聚合两种活性的冲突启示了自然界用两种聚合酶分别执行DNA合成起始及延伸的原因。..同时，在本项目支持下课题组发现了四种新型核酸酶功能并开发了其中三种在RNA体外合成中的应用，包括：.1..GajA DNA内切酶：首次研究存在于自然界8.5%细菌与古菌中的Gabija免疫系统机制并发现其中GajA蛋白质是一个受核苷酸浓度负调控的DNA缺刻内切酶，揭示了一种通过感知核苷酸浓度变化启动防御的精简高效的新型抗病毒机制。.2..T7-S43Y RNA聚合酶：通过定向进化方法和体外酶学研究发现了T7 RNA聚合酶的S43Y突变体，可同时降低转录中断和非特异性末端延伸，极大提高体外RNA合成纯度。.3..KP34 RNA聚合酶： phiKMV类噬菌体中首个被鉴定的单亚基RNA聚合酶，其功能特点是识别两类互不相关的转录启动子，其应用优势在于提高RNA末端精确性提高40倍。.4..VSW-3 RNA聚合酶：来自香格里拉高原冰湖，能够在低至4摄氏度条件下合成RNA，最大优势是不含T7 RNA聚合酶产物中普遍存在的双链RNA（dsRNA）副产物，dsRNA可引发严重的细胞毒性，因此VSW-3 RNA聚合酶对当前热门的mRNA药物、mRNA疫苗等研究与产业意义重大。