人肠道病毒2C蛋白通过抑制RNA识别通路调控宿主天然免疫的机制研究

Recently, coxsackievirus A6 (CA6) had gradually become one of the three major pathogens of HFMD. However, the pathogenic mechanism of CA6 and functions of the related proteins have rarely been reported in the world. In our previous study, we found that the ability of CA6-2C protein to induce cell death is strongly associated with viral release. In the present project, our preliminary results indicate that CA6-2C can inhibit the IFN-β promoter activity, which is achieved by regulating the protein expression levels of RNA recognition receptors RIG-I and MDA5. Therefore, we intend to further explore the molecular mechanism of CA6-2C protein on regulation of host innate immunity through RIG-I and MDA5 from protein, RNA and promoter levels. At the same time, to study the functional regions and amino acid mutants of CA6-2C protein by which to affect the regulation of RIG-I and MDA5 protein levels. Subsequently, to investigate whether the regulation of IFN-β levels by 2C protein is conservative in human enterovirus genus. Finally, we will explore the important role of CA6-2C protein on regulation of IFN-β levels in viral infection and replication cycles. These relevant results will clarify that 2C protein antagonizes host innate immunity by inhibiting the RNA sensing pathway, and provides new insight and potential targets for novel anti-HFMD drugs development.

近年来，柯萨奇病毒A组6型（CA6）逐渐成为手足口病的三大病原体之一。但目前国内外对CA6的致病机制及其相关蛋白的功能研究还鲜有报道。申请人此前研究表明，CA6-2C蛋白诱导细胞死亡的能力与病毒释放量有较大关联。本项目中，前期结果表明CA6-2C可以抑制IFN-β的启动子活性，而该抑制是通过调控RNA识别受体RIG-I及MDA5的蛋白水平来实现的。因此，我们拟从蛋白、RNA及启动子水平探讨CA6-2C通过RIG-I及MDA5来调控干扰素水平，从而对抗宿主天然免疫的机制。同时，研究影响CA6-2C调控RIG-I及MDA5蛋白水平的氨基酸突变体。探讨2C蛋白对IFN-β水平的调控是否在人肠道病毒属中具有广谱性。最后，揭示CA6-2C通过调控IFN-β水平对病毒感染复制的影响。相关成果将阐明2C蛋白通过抑制RNA识别通路的干扰素水平对抗宿主天然免疫，为新型抗手足口病药物研发提供新思路和潜在靶点。

柯萨奇病毒A组6型（CV-A6）作为肠道病毒的一员，自2008年爆发以来已成为手足口病的主要病原体，可感染儿童和成人，通常导致非典型的手足口病。宿主的先天免疫系统在肠道病毒的感染与复制中起着至关重要的作用。然而，宿主天然免疫与CV-A6病毒之间的关系，特别是其与病毒最保守的非结构蛋白——2C之间的相互作用，目前尚没有比较明确的研究。在本研究中，我们首次证实了CV-A6-2C蛋白可以抑制HEK293T细胞中IFN-β的产生。进一步的研究结果表明，CV-A6-2C蛋白可以与MDA5和RIG-I相互作用，并通过自噬-溶酶体途径诱导这些RNA传感器的降解。这种功能在肠道病毒EV-A71型和CV-B3的2C蛋白中也是保守的，但CV-A16-2C蛋白是一个例外，因为它不能正确的识别MDA5和RIG-I。通过部分截短体和氨基酸替代实验分析，我们确定了点突变CV-A6-2C-F28A显著降低了对MDA5和RIG-I的降解。但是，CV-A6-2C-F28A仍然能够与MDA5和RIG-I结合，这表明2C与这些蛋白质的相互作用是必不可少的，但对2C所介导的MDA5与RIG-I的降解还不足够。进一步的病毒感染体系实验结果表明，与野生型CV-A6病毒相比，2C-F28A突变的病毒可以导致感染后RD细胞中的IFN-β水平显著升高。与此同时，病毒的一步生长曲线结果表明，CV-A6-2C-F28A病毒的复制和释放都比野生型病毒明显减弱，这表明2C介导的免疫调节在肠道病毒的感染与复制中起着至关重要的作用。综上所述，我们的实验结果，为肠道病毒2C蛋白拮抗宿主抗病毒反应的潜在机制提供了新的认识，拓宽了我们对宿主与肠道病毒相互作用的认识，并可能以2C-F28位为靶点促进开发抗肠道病毒感染的创新药物或疫苗。