靶向HBx的双功能shRNA纠正HBV免疫耐受及分子机制

HBV infection cause acute, chronic and severe hepatitis, and is closely associated with increased risks of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Chronic HBV infection inhibits the innate and adaptive immunity, leading to immune tolerance, which become the main obstacles for effective HBV therapy. Based on our priority in research of liver immunology, we will first construct a bifunctional lentivirus vector with both HBx silence activity and immunostimulatory effect. Then we will observe the HBV inhibition effect and the activation of innate and adaptive immunity, esp. the ability to irritate HBV-specific CD8+ T cell responses, in HBV-infected hepatocytes and chronic HBV-infection murine model. Furthermore, we will explore the machanisms of the bifunctional vector-mediated reversal of HBV-induced immune tolerance by antibody blocking, cell depletion, cell adoptive transfer, knock-out mice, and intervene of signaling pathway. This research will provide novel therapeutic strategy for HBV persistent infection.

HBV感染可引起急、慢性肝炎和重型肝炎，与肝硬化、肝癌的发生密切相关，严重威胁人类健康。HBV慢性感染导致机体天然和获得性免疫耐受，成为影响抗HBV治疗效果的主要障碍。本研究拟利用我们长期从事肝脏免疫学研究的优势，在前期工作的基础上，构建兼具靶基因沉默效果又具肝脏免疫激活能力的双功能RNAi慢病毒载体，分别以HBV感染细胞系和HBV慢性感染小鼠为模型，观察其对肝脏免疫系统的激活作用，尤其是特异性地激活HBV特异性CD8+T细胞的免疫应答的能力；通过抗体阻断、细胞清除和过继转输、基因缺陷鼠及胞内信号通路的干预，探讨其纠正HBV介导的肝脏免疫耐受、有效抑制HBV复制和控制HBV感染的细胞和分子机制，为慢性HBV持续性感染的治疗提供新的思路和策略，为更合理地设计HBV治疗方案提供依据。

HBV感染可引起急、慢性肝炎和重型肝炎，与肝硬化、肝癌的发生密切相关，严重威胁人类健康。HBV慢性感染导致机体天然和获得性免疫耐受，成为影响抗HBV治疗效果的主要障碍。本研究利用我们长期从事肝脏免疫学研究的优势，在前期工作的基础上，构建了兼具靶基因沉默效果（沉默HBx）又具肝脏免疫激活能力（激活TLR7的ssRNA）的双功能RNAi慢病毒载体（ssRNA-HBx-shRNA），分别以HBV感染细胞系和HBV慢性感染小鼠模型体内证实了其有效抑制HBV复制（包括HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平）及激活HBV特异性CD8+T细胞的免疫应答的能力；进一步通过细胞和分子机制探讨，分别从细胞系、临床标本和小鼠模型中证明了HBV感染可诱导HBV特异性的肝脏内源性和系统性免疫耐受；重要的是，我们发现靶向HBx的双功能shRNA表达载体不仅具有很高的抑制HBV复制的能力，而且能够逆转HBV诱导的免疫耐受，并恢复机体对HBV的记忆性应答，逆转HBV诱导的CD8+ T细胞的功能失调和耗竭状态；通过抗体阻断、细胞清除和过继转输、基因缺陷鼠及胞内信号通路的干预，证实双功能表达载体对HBV慢性感染小鼠获得性免疫应答能力的逆转依赖于分泌IFN-的CD8+T细胞的功能的恢复，且双功能表达载体产生的ssRNA激活TLR7信号继而诱导I型干扰素的产生（ssRNA-TLR7-I型干扰素）对于逆转系统性免疫耐受（包括CD8+T细胞功能和抗HBs抗体产生能力的恢复）是必需的。成功构建了另一种靶向凋亡相关蛋白Pim-3的双功能shRNA表达载体（ssRNA-Pim-3-shRNA）亦在体内外展示出既通过靶向沉默Pim-3促进肿瘤细胞凋亡、又激活TLR7信号通路激活天然免疫应答、促进NK细胞抗肿瘤功能的双功能作用。在此基础上，进一步探讨了TLR7/8激动剂激发DC与NK细胞之间的cross-talk提高NK细胞抗肿瘤能力、HBx和HBc通过调节肝细胞或肝癌细胞表面NKG2D配体的表达逃逸NK细胞杀伤及HBV通过抑制炎症小体的活化逃逸免疫系统攻击的机制。本研究完善了HBV诱导肝脏免疫耐受形成的机制，为慢性HBV持续性感染和肝癌的治疗提供了新的思路和策略。