Tet3调节的DNA去甲基化对牛体细胞核移植胚胎早期发育的影响和机制研究

The incomplete reprogramming of nucleus resulting in the inefficiency of animal cloning and abnormal development of offspring, seriously constraints the application and development of somatic cell nuclear transfer (SCNT). One important reason for the incomplete epigenetic reprogramming is the disorder of DNA demethylation. Our previous research found Tet3 is the main enzyme to catalyze the DNA demethylate during the bovine zygote period. Therefore, through immunofluorescence staining, bisulfite sequencing and siRNA technology, we research the genome-wide 5mC/5hmC levels, the methylation situation of promoter region and expression dynamic changes of pluripotency-related genes and imprinted genes at the three different stage of IVF and SCNT embryo development (zygotes, 4 cell stage and blastocyst stage), and evaluate the quality of SCNT embryos. Then we can uncover the DNA methylation levels dynamic changes at the different embryos development stages, and whether Tet3 directly involved in the DNA demethylation of SCNT embryos. Thus, we can clarify the mechanism of the influence of Tet3 and Tet3 catalyzed DNA demethylation on the development of SCNT embryos. This will provide more experiment basis to the relevance of DNA demthylation and SCNT early embryos development, and provide rich theoretical basis for improving the efficiency of bovine SCNT works and transgenic cloned cattle breeding works.

细胞核不完全重编程导致动物克隆效率低下、后代发育异常，严重制约体细胞核移植（SCNT）技术的发展和应用。而DNA去甲基化异常是不完全表观重编程的重要原因之一。本实验室前期研究发现，牛合子中Tet3催化早期胚胎发生DNA去甲基化。以此为基础，本项目拟运用免疫荧光染色、亚硫酸盐测序、siRNA等技术，以不同发育阶段的体外受精和SCNT胚胎（合子、4-细胞、囊胚）为研究对象，检测全基因组5mc/5hmc水平、全能性相关基因和印记基因的表达及启动子区的甲基化状态，并评估囊胚质量，从而明确各阶段的SCNT胚胎DNA去甲基化动态变化；以及Tet3是否直接参与SCNT胚胎的去甲基化过程；旨在发现Tet3及其催化的DNA去甲基化对SCNT胚胎发育的影响，并初步阐明此影响的作用机制。进而揭示DNA去甲基化和SCNT早期胚胎发育的相关性，为提高牛克隆效率、开展转基因克隆牛育种工作等生产实践提供丰富的理论依据。

细胞核不完全重编程导致动物克隆效率低下、后代发育异常，制约体细胞核移植（SCNT）技术的发展。DNA去甲基化异常是不完全表观重编程的重要原因之一。TET蛋白是一种重要的去甲基化酶，可使5mc转化为5hmc，有助于维持基因组DNA甲基化图谱。本实验室发现，牛合子中Tet3催化早期胚胎发生DNA去甲基化，项目运用免疫荧光染色、亚硫酸盐测序、siRNA等技术，以不同发育阶段的IVF和SCNT胚胎为研究对象，检测全基因组5mc/5hmc水平、全能性相关基因和印记基因的表达及启动子区的甲基化状态，并评估囊胚质量。通过实验发现，在牛早期胚胎发育中，Tet3参与了IVF和孤雌激活胚胎的早期发育。SCNT胚胎中Tet3也发挥作用，但是与IVF胚胎相比却处于低水平。DNMT甲基化酶的表达模式也相似，DNMT1和DNMT3b对牛IVF及SCNT早期胚胎发育DNA甲基化起着调控作用，但在SCNT早期胚胎中表达量却大大降低。通过对SCNT胚胎的5mC，5hmC信号检测发现，牛SCNT着床前胚胎发育的过程中的DNA去甲基化出现异常。通过荧光信号强度检测发现Tet3参与了IVF、SCNT胚胎的去甲基化作用。在IVF胚胎中，基因表现出启动子区域的特异性的DNA甲基化动态变化模式：POU5F1和NANOG表现出去甲基化过程；H19表现出抵制去甲基化过程；SOX2和CDX2表现为持续的低甲基化状态。相关基因的表达和基因启动子区域的甲基化状态密切相关，启动子区域高甲基化，基因表达少。而特殊基因位点在牛SCNT附植前胚胎中表现出异常的甲基化状态，SCNT胚胎的启动子区域普遍高甲基化，而H19表现为过度地去甲基化。无论从IVF、SCNT胚胎还是孤雌激活胚胎，我们发现关于TET3参与牛胚胎早期发育的机制是：Tet3直接参与催化由5hmC调节的胚胎的DNA去甲基化过程，由于去甲基化的发生，使得一些印记基因或者多潜能基因和发育基因的启动子区域发生甲基化改变，进而使得与发育相关的基因表达发生改变，进而影响IVF、SCNT胚胎的发育。SCNT胚胎的发育异常也是因为去甲基化过程异常发生的。此实验结果和机制的揭示，有利于从TET3酶的角度去调整SCNT的重编程情况，提高SCNT胚胎的克隆效率和发育率。