Aβ调控miR-29b/c介导AQP4极性分布参与AD血脑屏障损伤的机制研究

The astrocyte polarization plays key role in the blood brain barrier (BBB), the mechanism within the BBB injury in AD remains unclear. Our previous study demonstrated that: 1) AQP4 redistributed in Arctic AD trangenic mice, implying disturbance of astrocyte polarization; 2) Diverse miRNA was differentially expressed in the coculture system with astrocytes and endothelial cells treated by Aβ; 3) The miRNA target predict software suggest that AQP4 and its achoring molecule LAMC1 were common target genes of miR-29b and miR-29c. In consideration of the latest research, we proposed that Aβregulates AQP4 distribution via miR-29b/c participating in astrocyte polarization. What we further to do: 1) verify the impact of Aβ on the astrocyte polarization, miR-29b/c and possible target genes; 2) explore the effect of miR-29b/c on the possible target genes; 3) explore the effect of miR-29b/c on astrocytic and endothelial function; 4) validate the target genes of miR-29b/c by luciferase reporter assay. The aim of the present study is to reveal the pathway how Aβ leads to astrocyte polarization injury, and provide direct proof for the mechanism underlying in the BBB breakdown in AD.

星形胶质细胞极性维持着血脑屏障的完整，AD中血脑屏障损伤的机制不明。课题组前期工作发现：1.在AD转基因鼠中AQP4极性改变，提示星形胶质细胞极性改变；2.Aβ处理星形胶质细胞与内皮细胞共培养体系后AQP4极性改变，多种miRNA出现差异表达；3.对相关miRNA分析发现，AQP4和AQP4极性分布相关分子LAMC1是miR-29b和miR-29c的共同靶基因。结合最新研究结果，我们提出假设：Aβ通过miR-29b/c调控AQP4极性分布介导星形胶质细胞极性的变化。本研究拟开展以下工作：1.验证Aβ对星形胶质细胞极性、miR-29b/c及靶基因的影响；2.过表达或抑制miR-29b/c对靶基因表达与活性的影响；3.过表达或抑制 miR-29b/c对星形胶质细胞及内皮细胞功能的影响；4.靶基因验证。本课题旨在阐明Aβ引起星形胶质细胞极性损伤的机制，为AD中血脑屏障损伤的机制提供直接实验证据。

淀粉样蛋白级联假说认为，β淀粉样蛋白（amyloid β, Aβ）的聚集是AD各种病变的始动因素。研究表明AQP4基因敲除可加重AD转基因鼠中Aβ的聚集和认知功能损害，提示AQP4介导AD中Aβ的清除途径障碍。前期工作表明，AQP4在AD转基因鼠星形胶质细胞中重新分布，但Aβ导致星形胶质细胞极性改变的机制有待在本研究中进一步阐明。AQP4的极性分布与dystrophin相关蛋白复合体和基底膜密切相关。数据分析发现，AQP4和基底膜成分LAMC1是miR-29c和miR-29b的共同靶基因，提示miR-29c和miR-29b可能在星形胶质细胞极性中发挥调节作用。基于此，本研究开展了以下工作：1.研究Aβ对星形胶质细胞极性和miR-29b/c的影响；2.研究过表达miR-29b/c对靶基因表达的影响；3.研究过表达或抑制 miR-29b/c对星形胶质细胞及内皮细胞功能的影响。结果发现：1.通过原代小鼠大脑皮层星形胶质细胞与小鼠脑内皮细胞系bEnd.3共培养，建立了星形胶质细胞极性分布的体外模型，Aβ42寡聚体处理后，伸向内皮细胞中的突起中AQP4表达下降，下层星形胶质细胞胞体中AQP4表达升高，提示极性改变及AQP4重分布体系建立；2.miRNA芯片检测及生物信息学分析显示10种miRNAs与血脑屏障通透性相关，其中miR-29b和miR-29c的表达差异最为显著；3.qPCR发现，Aβ42处理后共培养体系中miR-29b表达下降，miR-29c表达升高；4.构建miR-29b和miR-29c过表达慢病毒载体，转染重分布体系后，星形胶质细胞和内皮细胞标记以及功能变化；5.细胞外基质以及AQP4极性分布相关分子LAMC1蛋白水平改变。本研究在体外验证了Aβ可导致血脑屏障重要成分星形胶质细胞极性的改变，阐明了Aβ通过调节AQP4与相关极性分子MMPs、LAMC1，参与星形胶质细胞极性及血脑屏障损伤的机制，为AD中血脑屏障损伤的机制提供直接实验证据。