亚磺酸还原酶底物的整体发现及其调控肿瘤细胞氧化敏感性的分子基础研究

Protein sulfinic acids (S-sulfinylation) are formed by the reaction of reactive oxygen species with protein cysteinyl thiols, which has been suggested to be associated with high cellular oxidative stress. Extensive sulfinic acid formation on thiol proteome is one of the landmarks of cell death induced by oxidative stress. The discovery of sulfiredoxin (Srx) has demonstrated that cysteine sulfinic acid can be reversed in cellular systems. Srx, as a major antioxidant enzyme, has been suggested to be associated with cancer development, which is highly dependent on cellular antioxidant capacity. However, due to the methodological obstacle for detecting sulfinic acid, the substrate profile of Srx remains largely unexplored. In this regard, molecular mechanism of Srx-dependent redox modulation and its role in regulating oxidative susceptibility of cancer cells remain uncertain with respect to key questions. For example, how does Srx regulate the function of its substrates? Whether Srx-substrate axis promotes cancer progression? .The aims of this proposal is (1) to develop and optimize an analytical strategy for global profiling of targeted sites of protein S-sulfinylation using a novel sulfinic acid-specific probe and state-of-the-art quantitative chemoproteomics; (2) to perform the first proteome-wide survey of substrates of Srx in cells and investigate their functional interactions through traditional biochemical approaches and bioinformatics; (3) to explore the role of Srx-substrate axis in regulating oxidative susceptibility of cancer cells. .Taken together, this project will not only provide a valuable chemical tool for the study of biological regulation of protein S-sulfinylation in cells, but also lay the groundwork for the better understanding of the role of Srx and its substrates in cell biology and cancer development, which may eventually lead to a strategy for effective cancer treatment by targeting antioxidant systems.

亚磺酸修饰是一种发生在蛋白质半胱氨酸残基上的重要氧化修饰类型。细胞巯基蛋白质组的整体亚磺酸化水平过高是细胞在氧化应激条件下走向死亡的一个标志性分子事件。该修饰能够被亚磺酸还原酶（Sulfiredoxin，Srx）选择性地还原。因此，Srx是细胞抗氧化体系中的重要环节并且与许多肿瘤发生发展密切相关。迄今为止，Srx的底物位点及其调控肿瘤细胞氧化敏感性的分子机制仍不清楚。本项目首先拟建立一套基于新型亚磺酸特异性化学探针和定量化学蛋白质组技术的亚磺酸修饰整体分析策略。然后采用该策略系统地分析亚磺酸还原酶Srx的完整底物谱，并且在此基础上结合生化技术和生物信息学工具研究Srx对于其底物生物学功能的影响。最终，本项目还将进一步研究Srx-底物轴对于肿瘤细胞氧化敏感性的调控作用。本研究不仅能够为蛋白质亚磺酸修饰的研究提供一种重要的分析工具，而且有望探索出一种基于氧化致死的抗肿瘤策略。

亚磺酰化修饰作为一种重要的氧化修饰类型，是细胞走向死亡的一个标志性分子事件，可以调控多种关键生物学过程。该修饰可以被亚磺酸还原酶（SRX）还原，但由于亚磺酸修饰鉴定手段的局限，限制了我们对SRX底物的调控范畴的认识。在本项目中，我们发展了新型亚磺酸特异性的化学探针DiaAlk，并且将之与定量化学蛋白质组技术整合，最终我们从A549细胞和Hela细胞中鉴定到296个蛋白上387个亚磺酰化位点。生物信息学分析表明发生亚磺酰化修饰的蛋白广泛分布且参与多种生物过程，包括氧化还原、糖酵解和脂肪酸β-氧化等。为了鉴定SRX的底物，我们测定了srx基因敲除前后亚磺酸修饰谱的“恢复（还原）”速率，发现了>50个前所未知的 SRX 新底物。随后，我们利用化学蛋白质组学平台，结合特异性标记亚磺酸的探针BTD，对拟南芥1000多种蛋白质上的1537个次磺酰化位点进行了鉴定。通过对人类和拟南芥次磺酸数据集的比较获得了155个保守的次磺酰化位点，其中包括AtMAPK4的Cys181。将该位点突变后，发现突变体激酶活性降低，表明这种非催化半胱氨酸对激酶功能的重要性。为了拓展DiaAlk 的应用，我们描述了经 H2O2 处理后秀丽隐杆线虫体内三种主要半胱氨酸氧化还原形式的全局变化。数据表明氧化敏感蛋白参与翻译、生长信号和应激反应等多种生物学过程。我们重点研究了SEK-1和PMK-1是否在p38 MAPK介导的应激反应和病原体抗性中发挥氧化还原调节的作用。通过构建了点突变线虫模型，结合生化分析，发现PMK-1的C173和SEK-1的C213均参与氧化应激介导的p38 MAPK通路激活，并且后者对线虫抵御病原体也至关重要。综上所述，本项目发展了一种新型化学探针DiaAlk，鉴定了迄今为止最大规模的亚磺酰化修饰数据集，发现了>50 个前所未知的SRX 新底物，拓展了探针及建立的化学蛋白质组学平台在其他物种的应用，所获得的数据集为了解生物体内氧化还原信号转导提供了分子基础，也为该领域提供有丰富、有价值的氧化还原资源数据。