去分化脂肪细胞向起搏细胞的分化及其机制

生物心脏起搏器是目前心脏起搏研究的热点，寻找理想的种子细胞是构建生物心脏起搏器的首要任务。最新研究表明，去分化脂肪（DFAT）细胞在20%的胎牛血清培养条件下即可分化为起搏样细胞，可能是构建生物心脏起搏器的理想种子细胞，但其分化的起搏样细胞在体内、外是否具有起搏功能以及分化机制还需要进一步研究。本课题拟在文献和我们前期的工作基础上，首先通过起搏基因、起搏电流进一步研究起搏样细胞的起搏特征；然后通过起搏样细胞与心肌细胞共培养，观察带动心肌细胞跳动、形成细胞连接的情况；再种植于动物心外膜下，观察其是否能够形成异位起搏点；取材观察标记的起搏样细胞在体内的演变、起搏样细胞与宿主心肌细胞之间联系建立等情况，研究起搏样细胞在体外、体内的起搏功能，为下一步构建生物心脏起搏器提供实验依据。最后，通过进一步检测起搏相关的转录因子、沉默转录因子基因，初步探讨DFAT细胞向起搏样细胞分化的分子机制。

种子细胞是构建生物心脏起搏器的关键，尤其是将成体干细胞诱导为起搏细胞是研究的重点和难点。脂肪来源的干细胞容易获得、数量丰富、无免疫原性，是再生医学理想的种子细胞来源。文献报道，去分化脂肪（dedifferentiated fat, DFAT）细胞和脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells, ASCs）都可以分化为搏动的心肌样细胞，有可能成为生物起搏器的种子细胞，但细胞的组织来源、搏动细胞的起搏特性以及分化机制都需要进一步研究。本项目比较白色和棕色脂肪内DFAT细胞和ASCs向搏动心肌细胞的分化能力。其次，鉴定了棕色脂肪ASCs（BASCs）来源的搏动心肌样细胞的起搏特征，并对其分化机制进行了探讨。最后对BASCs在三维支架材料中的增殖和分化进行了研究。结果表明：（1）来自棕色脂肪的DFAT细胞和BASCs无需特殊诱导，在含有15%胎牛血清的DMEM培养基中，部分细胞会分化为搏动的心肌样细胞，搏动频率高低不一。BASCs更易培养和获得，以及用于进一步的研究。（2）BASCs来源的搏动细胞具有起搏细胞或传导细胞的特征，表达心肌细胞特异性蛋白Sr和cTNT以及窦房结细胞特有的HCN4和Cx30.2蛋白；起搏细胞发育相关的因子Tbx3、Tbx18、Shox2在诱导过程中有升高的现象。搏动细胞呈现4期自动去极化的自发性动作电位，有自发性的细胞内钙瞬变，药理学实验表明心血管活性药物对其收缩活动能产生有效的激动或抑制作用；透射电镜下具有横纹结构，但肌丝排列紊乱且不发达。（3）经典Wnt通路抑制剂Dkk1处理后，BASCs向起搏样细胞的分化率明显提高，起搏细胞发育相关基因和蛋白表达明显上调。下调Tbx18可以引起下游的Tbx3和Shox2表达减少，并抑制了起搏细胞的特异性蛋白的表达，细胞搏动停止。（4）BASCs在胶原海绵、明胶海绵和透明质酸水凝胶三种支架材料中生长良好，并均能表达起搏细胞标志。细胞-水凝胶支架复合物可产生搏动，可能更适用于生物起搏器的构建。本项目发现只有棕色脂肪来源的干细胞在不加特殊诱导剂的条件下，可以向起搏样细胞分化，其机制可能与Wnt通路、起搏发育相关的转录因子有关，但始动因素尚不清楚。BASCs可以在三维条件下向起搏样细胞分化，但细胞的频率、纯度还有待进一步的提高，才能用于生物心脏起搏器的构建。