人CLEC9A+BDCA3+树突状细胞交叉递呈自噬小体作用及机制研究

Human CLEC9A+BDCA3+ DC subset cross-present cell-associated antigen most efficiently. We have demonstrated that tumor cell-derived autophagosome can cross-prime immune response and treat tumors in mice. Our preliminary data showed that 1) autophagosome is mainly cross-presented by CLEC9A expressing DC in mice; 2) autophagosome can induce efficient cross-presentation by human PMBC; 3) human blood CLEC9A+BDCA3+ DC can cross-present autophagosome more effectively compared with other DC subsets in human PBMC. As human CLEC9A+BDCA3+ DC is the equivalent of mouse CLEC9A+ DC, we hypothesized that human CLEC9A+BDCA3+ DC can recognize and engulf tumor derived autophagosome, then cross-prime tumor antigen specific CD8+ T cells. We will sort the human CLEC9A+BDCA3+ DC from PBMC and test this hyphthesis by flow cytometry, ELISPOT, CBA, confocal laser scan microscopy, and so on. At the same time, we will generate human CLEC9A+BDCA3+ DC from human CD34+ HPCs and examine their ability to cross present tumor associated antigen, prime tumor-specific T cells, and exhibit antitumor immune reseponses. Our research will establish the basis for novel DC vaccines based on tumor-derived autophagosomes.

人CLEC9A+BDCA3+ DC能有效交叉递呈细胞相关抗原，但其对细胞来源自噬小体的交叉递呈作用不详。我们在小鼠中证实肿瘤细胞自噬小体能有效交叉激活免疫反应，起到肿瘤治疗性疫苗功能。预实验结果：1.小鼠中自噬小体主要由表达CLEC9A的DC交叉递呈；2.自噬小体可被人PBMC交叉递呈，其中CLEC9A+BDCA3+ DC能最有效交叉递呈自噬小体。研究表明小鼠CLEC9A+ DC与人CLEC9A+BDCA3+ DC是等效物。我们推测“人CLEC9A+BDCA3+ DC能够识别吞噬肿瘤细胞自噬小体，介导其进入交叉递呈途径，激活肿瘤特异性CD8+ T细胞”。我们拟分选人PBMC中CLEC9A+BDCA3+ DC，利用流式细胞术、ELISPOT、CBA等证实这一假说，并拟实现体外培养CLEC9A+BDCA3+ DC，证实其联合肿瘤细胞自噬小体的抗肿瘤作用。此研究将为新型DC疫苗的开发提供新思路。

人CLEC9A+BDCA3+ DC能有效交叉提呈细胞相关抗原，但其对细胞来源自噬小体的交叉提呈作用不详，体外培养DC联合自噬小体是否能有效激活抗原特异性T细胞并用于肿瘤患者的治疗也尚未可知。为此，我们开展了下列研究：1.研究人外周血中CLEC9A+BDCA3+ DC亚群负载包含CMV pp65蛋白的自噬小体（CMV pp65 DRibbles）后激活抗原特异性T细胞作用；2.研究体外培养获取的两种单核细胞来源DC（IFN-DC与IL-4-DC）的表型、功能的区别，并比较其体外交叉提呈CMV pp65 DRibbles作用；3.将IFN-DC联合肝癌来源的SMMC7721-DRibbles用于肝癌患者的免疫治疗，探讨其是否能够激活体内抗原特异性T细胞，并研究其安全性、可行性。除此之外，我们还研究了共刺激信号增强的工程细胞（ECCE）（稳定表达4-1BBL的K562细胞）刺激传统细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖、细胞因子分泌及杀伤作用。我们发现：1.人外周血中的CLEC9A+BDCA3+ DC亚群负载包含CMV pp65 DRibbles后能够有效激活抗原特异性T细胞；2.与IL-4-DC相比，IFN-DC能分泌更多的细胞因子，交叉提呈DRibbles作用更强；3. IFN-DC联合SMMC7721-DRibbles治疗肝癌患者安全、可行，能够激活体内抗原特异性T细胞；4.ECCE能够有效的促进细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖，增强其体外杀伤肿瘤细胞功能，并具有抗HBV作用。我们的研究为CLEC9A+BDCA3+ DC亚群、单核细胞来源DC联合肿瘤自噬小体疫苗DRibbles用于免疫治疗奠定了基础，并且我们还提供了一种有效扩增免疫效应细胞的新方法。