金黄色葡萄球菌表面蛋白IsdB单链抗体-人β防御素3融合蛋白的细菌诱导型表达及其抗菌活性

Mastitis is one common disease, which is difficult to conquer, in dairy cattle. Human β-defensin 3 (HBD3) is a small cationic peptide with a wide range of antimicrobial activities, and it takes part in non-specific immunity of mammary glands. Milk protein promoter can regulate exogenous antimicrobial peptides to express as milk protein expressing by recombinant-DNA technique. However, there are some problems in this strategy. First, antimicrobial peptide expression only in the lactation period cannot prevent mastitis during dry period. Second, constant expression of antimicrobial peptide in lactation period may bring some adverse effects on the safety of dairy products and breast physiological function. Therefore, we plan to kill Staphylococcus aureus by the fusion protein of anti-Staphylococcus aureus surface protein IsdB single chain antibody and HBD3. Moreover, we attempt to use bacteria inducible IL-1α promoter to precisely control the expression of fusion protein from time and space, thereby to resist mastitis and to avoid the negative effects of sustained expression. We try using mammary epithelial cells and breast tissue to detect if the promoter has the ability to regulate fusion protein to express in the presence of bacteria, and to detect if the fusion protein has the ability to kill bacteria and how the efficiency is, thus validating feasibility of mastitis prevention by the combination of bacteria-induced expression system with antibody targeting drug technology. The study will provide a new idea and method for mastitis prevention and treatment.

乳腺炎是奶牛业中较难攻克的一种常见疾病。人β-防御素3（HBD3）是一类广谱抗菌的阳离子多肽，在乳腺非特异性免疫过程中起一定作用。利用乳蛋白启动子调控抗菌肽表达，可使外源抗菌肽随着乳蛋白表达而表达，从而起到抗乳腺炎的作用。这种策略存在一些问题。首先，抗菌肽只在泌乳期表达，不能防治干奶期乳腺炎。其次，抗菌肽在泌乳期持续表达，对奶品安全和乳腺生理功能可能存在不利影响。因此，本研究设想利用抗细菌表面蛋白IsdB单链抗体与HBD3融合，提高HBD3杀灭乳腺炎金黄色葡萄球菌的效率，同时利用细菌诱导型IL-1α启动子调控单链抗体-HBD3融合蛋白表达，从时间和空间上精确控制该蛋白表达，既能提高抗乳腺炎作用效率，又可避免抗菌肽持续表达的负效应。利用乳腺上皮细胞和乳腺组织，检测蛋白诱导表达效率和杀菌效果，验证细菌诱导表达系统结合抗体靶向给药技术防治乳腺炎的可行性。本研究将为乳腺炎的防治提供新的思路和方法。

乳腺炎是奶牛业中较难攻克的一种常见疾病。利用乳蛋白启动子调控抗菌肽人β-防御素3（HBD3）表达，可使外源抗菌肽随着乳蛋白表达而表达，从而起到抗乳腺炎的作用。但是这种策略不能防治干奶期乳腺炎，抗菌肽在泌乳期持续表达对奶品安全和乳腺生理功能可能存在不利影响。因此，本研究利用金黄色葡萄球菌表面蛋白IsdB单链抗体与HBD3融合，提高HBD3杀灭乳腺炎金黄色葡萄球菌的效率，同时利用细菌诱导型启动子调控抗IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白(IsdB-HBD3)表达，从时间和空间上精确控制该蛋白表达。获得如下结果：（1）利用牛酪蛋白增强子(BCE1)和IL1-α启动子构建了细菌诱导复合型启动子，在细菌诱导下该复合启动子在乳腺上皮细胞中具有组织特异性，降低了IL1-α启动子在小肠上皮细胞中的活性；（2）克隆了金葡菌表面蛋白IsdB抗体基因序列，与HBD3基因融合，利用真核表达和纯化系统制备纯度约为90%，浓度为1 mg/ml的融合蛋白；亲和性和抗菌实验结果表明，IsdB-HBD3融合蛋白具有效结合金葡菌IsdB蛋白的活性，对金葡菌的杀菌活性比HBD3高出5倍；（3）利用上述复合型启动子和IsdB-HBD3融合基因，构建了细菌诱导型表达载体pIsBD，转染乳腺上皮细胞，利用热灭活的大肠杆菌或者金葡菌攻菌，ELISA和western blot结果显示灭活大肠杆菌诱导组IsdB-HBD3表达量在诱导3 h为最高（23 mg/L）；灭活金葡菌诱导组IsdB-HBD3在诱导后9 h目的表达量最高（9 mg/L）；（4）利用本实验室优化的电转染条件，将诱导表达载体转染小鼠乳腺组织，利用活细菌感染小鼠乳腺，Western blot结果显示大肠杆菌和金葡菌感染感染后3h IsdB-HBD3融合蛋白表达；大肠杆菌感染实验组6 h收集的乳汁检测板中的菌落比对照组显著降低（p<0.001）；金葡菌感染实验组诱导9-12 h菌落数与对照组相比明显下降（p<0.05）。本研究建立的细菌诱导型表达载体，可以从时间和空间上精确控制靶向抗菌肽的表达，既能提高抗乳腺炎作用效率，又可避免抗菌肽持续表达的负效应。本研究成果对提高抗病转基因动物的生物安全性有重要意义。