iNOS蛋白质糖基化修饰的类型、结构及生物学功能研究

Nitric oxide synthases (NOS) are key enzymes responsible for the biosynthesis of NO. The family of NOS generally falls into three isoforms: nNOS, iNOS and eNOS. Among them, iNOS is often involved in the occurrence and development of critical diseases caused by inflammation. The expression level of iNOS is parallel with disease severity. Study of iNOS activity regulating mechanism has profound significant influence on the treatments of critical diseases. Glycosylation is an important post-translational modification of proteins, and it has an important impact on the biochemical properties and functions of proteins. Aberrant glycosylation always leads to severe diseases. We have confirmed that iNOS was glycosylated. We supposed that the glycosylation of iNOS had vital biological function and it might function in the development of inflammation related diseases. This project is going to study deeply and systematically on the type, structure and biological function of glycosylation in iNOS, using mass spectrometry, biochemistry and molecular biology methods. It will be helpful to further reveal the mechanisms regulating iNOS activity, and to provide new ideas and methods for prevention and treatment of inflammation related diseases.

一氧化氮合酶（NOS）是NO生物合成的关键性催化酶，可分为nNOS、iNOS和eNOS三种。其中，iNOS常通过引起炎症参与重大疾病的发生和发展，其表达量与疾病恶化程度有平行关系，研究iNOS活性调节机制对这些重大疾病的治疗具有深远意义。糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，对蛋白质的性质和功能有多方面的重要影响，糖基化修饰异常可导致严重的疾病。我们发现iNOS蛋白质中存在糖基化修饰，推测其对iNOS的生化性质和生物学功能有重要影响，很可能在炎症相关疾病的发生发展中有重要作用。本申请将利用质谱技术、生物化学和分子物学手段对iNOS蛋白质糖基化修饰的类型、结构和生物学功能进行深入系统的研究。通过该项目研究，可进一步揭示iNOS活性调节机制，为炎症相关疾病的预防及治疗提供新的思路和方法。

蛋白质翻译后修饰是指蛋白质在翻译或翻译后进行的，常由酶催化的共价连接修饰，其功能具有多样性且在所有的生命活动中起重要作用。约50～90%的人类蛋白质具有翻译后修饰。翻译后修饰可以调节蛋白质的活性、半衰期、细胞定位及蛋白质间的相互作用等。.N-糖基化修饰是寡糖链通过β-构型的N-乙酰葡糖胺与天冬酰胺连接的一种修饰形式。被修饰的天冬酰胺通常处于N-X-S/T/C序列中，其中X是除脯氨酸外的任一氨基酸残基。作为细胞壁和胞外基质的组成成分、影响蛋白质的性质（如蛋白质的稳定性和可溶性）、指导糖蛋白的运输和传导细胞信号都是N-糖链的功能。据预测，约70%的真核生物蛋白质都是N-糖基化修饰蛋白。N-糖基化修饰缺陷会导致各种疾病，且绝大多数是神经系统疾病。.NO是功能多样的信号分子，备受关注。一氧化氮合酶（NOS）是负责催化NO合成的关键酶，它在NADPH、BH4（tetrahydrobiopterin）、FAD、FMN等辅因子的帮助下，以 L-精氨酸为底物，经多步氧化还原反应合成NO。NOS 可分为nNOS、iNOS及eNOS。nNOS 和eNOS 组成型表达，统称为构成型NOS（cNOS）。cNOS 催化生成的NO 量较少，调节各种生理功能。与cNOS 相比，iNOS 在表达、生理功能等方面都有其独特之处，通常在疾病过程中起作用。.目前，已经有磷酸化、硝基化、O-连接的氮乙酰葡糖胺修饰、范素化、酰基化等几种翻译后修饰对NOS活性调节的相关报道，但这些研究结果多来自eNOS的研究。iNOS的研究主要集中在转录调节水平。炎症模型中的iNOS蛋白质经富集后，凝集素染色证实iNOS具有N-糖基化修饰，质谱鉴定N-糖基化修饰位点为Asn695。将Asn695突变为Gln后，iNOS的酶活性提高了。通过对iNOS的模拟结构分析，我们推测Asn695位的N-糖基化修饰可能通过延迟FMN结合结构域向血红素的电子传递而抑制酶活。.我们是第一次发现iNOS蛋白质有N-糖基化修饰；糖基化修饰对蛋白酶活性通常具有提高作用，但iNOS中的N-糖基化修饰却对酶活性起抑制作用；检测所用的iNOS蛋白质来自炎症模型，推测与炎症相关疾病的发生发展中有关，可为炎症相关疾病的治疗提供新思路。