α1,6岩藻糖基化修饰对于Met介导生物学功能影响研究

Met is the hepatocyte growth factor (HGF) receptor, which is thought to be important in carcinogenesis. Recently, we found thatα1,6-fucosyltransferase （Fut8） gene knockout could inhibit the responses to HGF in HCC cell line, which indicate that Met is an N-glycosylated protein, and core fucosylation could affect its biological fuctions. In this study, Western blot, lectin blot, immunoprecipitation, immuofluorescence will be employed in different cells, to confirm the regulatory role of α1,6 fucosylation on Met and clarify possible mechanisms. Therefore, the present study might provide the basis for Fut8 using as novel potential therapeutic targets for tumor treatment.

Met是肝细胞生长因子（HGF）受体，与包括肿瘤在内的一系列病理过程密切相关。近期研究发现，α1,6岩藻糖基转移酶（Fut8）基因敲除可以降低细胞对于外源性HGF的反应性， 提示Met是N-糖基化修饰的糖蛋白，Fut8催化产物core fucose可能影响了Met的功能。本研究在此基础上，建立不同肿瘤组织来源的Fut8 基因Knockout和Knockdown 稳定细胞株，通过Western blot，lectin blot，免疫沉淀，免疫荧光，同位素标记等方法，观察在不同细胞系里由HGF诱导的细胞增殖，下游信号传导，Met二聚体形成以及配体受体亲和力变化，阐明core fucose对Met介导的生物学功能影响及其可能机制，部分解析高表达core fucosylation在肿瘤发生发展过程中的作用，为Fut8可能成为多种恶性肿瘤治疗新靶点提供理论基础。

Met作为肝细胞生长因子（HGF）受体，是原癌基因MET编码的一种跨膜酪氨酸激酶蛋白，被证实与包括肿瘤在内的一些病理过程密切相关。调节HGF-Met受体通路，能够抑制肿瘤生长和转移，作用于该通路的许多药物是近年来抗肿瘤药物研究的热点。N-糖基化是一种重要的翻译后修饰过程，能够调节相关蛋白质多种生物学功能。α1,6岩藻糖基转移酶（Fut8）是哺乳动物体内唯一可以催化形成核心岩藻糖(core fucose, α1,6 fucosylation) 结构的岩藻糖基转移酶。本研究在建立HepG2 FUT8 KO稳转细胞模型基础上，在HepG2 WT和FUT8 KO细胞中分别通过avidin（细胞膜蛋白）和PhoSL（特异性识别核心岩藻糖）进行免疫沉淀，所得到蛋白通过免疫印迹（IB with c-Met）检测，发现HepG2 WT和HepG2 FUT8 KO组细胞膜蛋白和总蛋白中c-Met表达无明显差异，而在经过PhoSL免疫沉淀过的FUT8 KO组蛋白中，c-Met条带基本缺失，提示c-Met是被核心岩藻糖修饰的糖蛋白。同时，在HGF短时间刺激后，FUT8 KO细胞c-Met及下游信号通路磷酸化水平较WT细胞显著降低，提示核心岩藻糖结构的缺失导致了c-Met对其配体HGF的反应性明显降低。进一步检测不同细胞在HGF诱导下的增殖状况。与WT细胞相比，HGF诱导FUT8 KO细胞增殖显著减弱，同时细胞周期蛋白Cyclin D1 和Cyclin E1蛋白表达与细胞增殖趋势一致，与细胞增殖相关c-Met不同磷酸化位点（Tyr 1234/5和 Tyr1349）及其下游信号通路磷酸化水平在FUT8 KO细胞中也较WT细胞显著降低。此外，对HepG2 WT细胞使用岩藻糖基转移酶抑制剂，2-氟代岩藻糖（2-FF）预处理，对于HGF诱导细胞增殖同样也具有抑制作用。对HepG2 FUT8 KO细胞进行基因拯救，与FUT8 KO组相比， RES／DOX组由HGF诱导的细胞增殖得到一定程度恢复，同时c-Met及其下游信号通路磷酸化水平也得到部分恢复。综上所述，本研究证实c-Met作为具有核心岩藻糖结构的糖蛋白，该结构存在与否影响了c-Met介导的细胞增殖功能，部分解析了core fucose高表达在肿瘤病理过程中的作用，为Fut8可能成为抗肿瘤治疗新靶点提供理论依据。