基于BEIIb蛋白磷酸化的水稻淀粉合成多酶复合体解析及功能研究

Rice eating quanlity is determined by the starch compositions, structue and its physicochemical properties, understanding the regualtion of starch biosynthesis pathway may accelerate rice eating quality improvement. The enzymes do not participate starch biosynthesis one by one, but instead simultaneously or in combination. In other words, they form multiple enzyme complex (MEC) or there are protein-protein interactions in rice endosperm during starch biosynthesis. The formation of the MEC depends on protein phosphorylation, however, whether phosphorylation presents in the enzymes and how they regulate the formation of MEC have not been well understood in rice. We have previously indetifed phosphorlated protein, peptide and loci in the developing seeds and further validated the presence of phosphorylation in starch branching enzyme IIb (BEIIb). In this project, we will make point mutation in the phosphorylated locus, and transform the mutant BEIIb and its wildtype to the beIIb mutant rice (indica rice Guangluai 4), to investigate the effect mutations in the phosphorylated locus in BEIIb on enzyme activities, starch biosynthesis-related gene expression and starch properties, to investigate the protein-protein interactions by different approaches, such as Co-immunoprecipitation, and yeast two hybrid assay. Our study will confirm the existence of MEC in the deloveloping rice seeds and BEIIb phosphorylation plays important roles in the formation of MEC for starch biosynthesis. Upon completion, our project will provide genetic and biochemical insight for quality formation and provide a solid foundation for the molecular design of the high quality rice.

稻米食用品质主要受淀粉组成、结构及其理化特性所制约,阐明淀粉合成的调控机制将促进稻米品质的改良。参与淀粉合成的酶在淀粉合成过程中不是单独作用,而是通过形成多酶复合体协同参与淀粉合成。多酶复合体的形成依赖于蛋白磷酸化，而水稻淀粉合成过程中蛋白磷酸化及其调控多酶复合体形成的机理尚不明确。在前期通过磷酸化蛋白质组学鉴定出大量的磷酸化蛋白、磷酸化肽段和磷酸化位点，并验证了水稻淀粉分支酶BEIIb存在磷酸化位点的基础上，本项目拟构建BEIIb磷酸化位点的定点突变体，获得BEIIb磷酸化位点突变的转基因水稻，检测蛋白质磷酸化对淀粉合成相关酶活性、基因表达及淀粉品质的影响，利用免疫共沉淀、酵母双杂交等多种技术手段检测并验证淀粉合成过程中存在多酶复合体，解析突变体及野生型多酶复合体的异同，阐明BEIIb磷酸化对多酶复合体形成及调控机制。本项目将为探明稻米品质形成的遗传及调控机理提供基础。

稻米食用品质主要受淀粉组成、结构及其理化特性所制约,阐明淀粉合成的调控机制能促进稻米品质的改良。参与淀粉合成的酶在淀粉合成过程中不是单独作用,而是协同作用，即形成多酶复合体参与淀粉合成。多酶复合体的形成依赖于蛋白磷酸化，而水稻淀粉合成过程中蛋白磷酸化及其调控多酶复合体形成的机理尚不明确。我们通过磷酸化蛋白质组学鉴定出大量的磷酸化蛋白、磷酸化肽段和磷酸化位点，发现BEIIb的两个磷酸化位点（Ser685和Ser715）在几次检测中都有鉴定到。Ser685 磷酸化位点位于结构域CH13(Glycosyl hydrolase, family 13, catalytic domain)中，在所有植物 BEs 中都是保守，并且在BEI的对应位点上也检测到了磷酸化修饰，说明这一位点的调控作用可能具有普遍性。而Ser715 仅出现在水稻 BEIIb 中，可能具有独特的调控作用。制备检测这两个位点的抗体，检测不同发育时期的种子胚乳磷酸化蛋白的表达，发现两个磷酸化位点随着发育进程而变化，温度也影响磷酸化蛋白的表达量。为了验证它们的功能，找到一个BEIIb的突变体，将正常BEIIb基因转回到突变体中，发现有些植株能恢复突变表型；另将磷酸化位点的丝氨酸突变成丙氨酸后的BEIIb基因转入突变体，发现也能恢复心白表型。部分转基因植株中能检测到BEIIb蛋白表达量明显提高。后续的转基因水稻多酶复合体鉴定及蛋白-蛋白互作正在进行中，进一步的探索有望发现磷酸化位点的变化对蛋白复合体的影响，使我们对水稻淀粉合成与调控有更多了解。