金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶细胞壁结合功能域的筛选、作用机制及应用研究

Staphylococcus aureus (S. aureus) is one of the major pathogenic bacteria in infectious diseases and bacterial food poisoning. How to realize a simple, fast, and sensitive detection of S. aureus has become a research hotspot, and developing novel recognition element is significant in the improvement of S. aureus detection technology and the control of cost. In our proposed research project, cell wall binding domain (CBD), the lysin of isolated bacteriophages, was identified in the genome by sequence analysis and was expressed by using E. coli to screen specific CBDs towards S. aureus. In order to reveal the interactions mechanism between CBDs and S. aureus, the three-dimensional structure of CBDs would be resolved. Our proposed project is of great significance in academy and application. On one hand, the mechanism of different CBDs towards S. aureus could be explained and novel recognition sites for the antibacterial agents would be found, on the other hand, it is important that CBDs are utilized as recognition element for specific detection of S. aureus with rapidity and high sensitivity.

金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在,，可在适宜条件下迅速增殖，产生毒素，是引起感染性疾病和细菌性食物中毒的一种重要病原菌。如何实现金黄色葡萄球菌简单、快速、灵敏检测是临床微生物学研究的热点之一，发展新型识别分子对金黄色葡萄球菌检测技术的提高和成本的控制具有重要意义。申请项目提出从金黄色葡萄球菌野生型噬菌体基因组中利用生物信息学推定出编码噬菌体裂解酶细胞壁结合功能域（cell wall binding domain，CBD）序列，通过与已报道CBD序列相比较，以期筛选到与金黄色葡萄球菌特异性结合的CBD。申请项目拟对CBD蛋白晶体结构进行解析，探讨CBD与金黄色葡萄球菌相互作用机制，并基于CBD为识别元件构建金黄色葡萄球菌的临床检测方法。项目的研究成果既能为新型抗菌分子的筛选提供潜在的靶标，又能为金黄色葡萄球菌的检测提供高亲和力和特异性的CBD，具有重要的学术意义和临床应用价值。

金黄色葡萄球菌是引起感染性疾病和细菌性食物中毒的一种重要病原菌，严重危害人类的身体健康和生命安全。对金黄色葡萄球菌进行防治，一是发展新型的抗菌物质；二是发展新型的检测方法实现其快速准确检测。噬菌体裂解酶在噬菌体裂解周期的末期开始合成，可以自内向外水解细胞壁肽聚糖从而裂解细菌。噬菌体裂解酶细胞壁结合功能域（cell wall binding domain, CBD）通过与细菌细胞壁糖基相结合，具有与噬菌体相对应的宿主特异性。噬菌体裂解酶CBD如何与宿主菌分子相互识别尚未研究透彻，首先我们以噬菌体Φ1裂解酶plyV12 CBD为研究对象，采用荧光成像技术从分子水平研究了CBD与宿主菌的相互作用，为噬菌体裂解酶治疗金黄色葡萄球菌引起的感染提供理论依据，也为新型抗菌分子的筛选提供潜在的靶标。针对金黄色葡萄球菌的快速检测，利用新型识别元件构建了几种检测体系。(1)利用金黄色葡萄球菌表面含有的大量蛋白质A为抗原表位，使用鸡抗蛋白质A IgY为配对元件，能在60 min内实现病原菌的快速检测，检测灵敏度为230 CFU/mL，并将该方法成功用于牛奶或苹果汁等样本的检测。(2)基于金黄色葡萄球菌蛋白质A双识别模式建立一种金黄色葡萄球菌检测方法，使用鸡抗蛋白质A IgY和IgG为识别元件，1个金黄色葡萄球菌蛋白质A具有5个哺乳动物IgG Fc段的结合位点，起到信号放大的效果，检测限为110 CFU/mL，可媲美PCR。该方法适用于生理盐水注射液、果汁和人尿液样本中金黄色葡萄球菌的检测。(3)再次利用蛋白质A为抗原表位，我们发展了一种基于狗IgG为识别元件的金黄色葡萄球菌检测平台，由于狗IgG通过其Fc端与蛋白质A具有较强的亲和力，而与蛋白质G的亲和力较弱，在一定程度上消除产蛋白质G链球菌的干扰，提高检测体系的特异性，该方法在90 min内能检测到100 CFU的金黄色葡萄球菌。本项目的研究成果为金黄色葡萄球菌的防治提供了有效的理论指导并有着实际的应用价值。