Wnt5a介导脱细胞干细胞基质抑制软骨细胞肥大化的分子机制研究

Synovial mesenchymal stem cells (SMSCs) are considered the most ideal seed cells currently to repair the meniscus damage. But our research team found the neomeniscus will be calcified due to the hypertrophy of chondrocytes differentiated from SMSCs. We also found that decellularized cellular matrix deposited by stem cell (DSCM) could inhibit hypertrophy of chondrocytes. There is no related mechanism research currently. Preliminary experiments found that Wnt5a were highly expressed both in the process of proliferation and differentiation when SMSCs were induced in the DSCM. In the process of cartilage differentiation, P38 MAPK promoted chondrocytes differentiation by inducing SOX9 expression, NF-κB inhibited the hypertrophy of chondrocytes by inhibiting RUNX2 expression. Our team will analysis the signaling pathways about how DSCM inhibit hypertrophy of chondrocytes, especially Wnt5a mediated signaling pathway. Our team will expose the molecular mechanism about how DSCM inhibit hypertrophy of chondrocytes and confirmed the key signal molecule by promoting/inhibiting the key related signal molecules using RNA interference and adenovirus transfection. The ultimate goal is to conquer the challenge existing in the process of the treatment of meniscus injury.

滑膜间充质干细胞(SMSCs)目前被认为是修复半月板最理想的种子细胞。但本课题预实验发现SMSCs分化的软骨细胞具有肥大化倾向，使新生的半月板钙化，同时亦发现SMSCs合成的脱细胞干细胞基质(DSCM)具有抑制肥大化作用。目前尚无DSCM抑制肥大化机制的研究。本课题预实验发现SMSCs于DSCM中增殖及成软骨细胞分化过程中Wnt5a都高表达。软骨细胞分化过程中，激活P38 MAPK可诱导SOX9表达，促进分化；激活NF-κB可抑制RUNX2表达，抑制肥大化。本研究拟在进一步确证上述现象基础上，深入分析DSCM抑制软骨细胞肥大化的分子机制，特别是Wnt5a介导的信号通路。本研究拟特异性的激动和抑制信号通路中关键分子，利用RNA干扰和腺病毒过表达关键转录因子，探明DSCM抑制软骨细胞肥大化分子机制，明确关键作用信号分子，为解决SMSCs在修复半月板中遇到的问题及临床上半月板钙化找到有效的方案。

背景：半月板损伤后很难自我修复，且会加速骨关节炎的进展。间充质干细胞(MSCs)是半月板软骨组织工程中理想的细胞来源。MSCs分化成的软骨细胞具有肥大化倾向，使形成的半月板组织钙化。SMSCs合成的脱细胞干细胞基质(DSCM)能够提高干细胞增殖及成软骨分化，抑制肥大分化。Wnt5a在介导软骨细胞肥大化中起重要作用。我们假设：Wnt5a-P38MAPK-SOX9通路促进成软骨分化，Wnt5a-NF-κB-RUNX2通路抑制肥大化。内容：1.诱导软骨细胞肥大化影响半月板修复现象的确证；2.DSCM抑制软骨细胞肥大化的研究；3.Wnt5a等信号通路介导DSCM抑制肥大化分子机制的研究；4.体内/外验证Wnt5a抑制软骨细胞肥大化的研究。结果：SMSCs经肥大化诱导培养后，其细胞形态出现明显的肥大化表型。将SMSCs置于含和不含DSCM的培养基中培养，于不含DSCM培养基中的SMSCs表现出肥大化形态，而置于DSCM中的SMSCs保持其干性形态。DSCM可以提高SMSCs增殖及成软骨能力，抑制肥大化。SMSCs置于传统Plastic和DSCM中培养，在增殖阶段，DSCM中Wnt5a表达量约是Plastic中的5倍，于成软骨分化阶段，DSCM中Wnt5a表达量亦约是Plastic中的5倍。SMSCs置于含Wnt5a和不含Wnt5a的培养基中培养，经Wnt5a扩增培养的SMSCs成软骨分化能力较强，能够促进软骨基因表达，抑制肥大化基因表达。PD98059细胞增殖抑制剂。SMSCs置于含和不含PD98059的Plastic中及含和不含PD98059的DSCM中培养，SMSCs于含PD98059的培养基中扩增时，其增殖能力较对照组显著减弱。SB203580为成软骨分化抑制剂。SMSCs置于含和不含SB203580的Plastic中及含和不含SB203580的DSCM中扩增培养后成软骨诱导分化，SMSCs于含SB203580的培养基中扩增时，其成软骨分化能力较对照组显著减弱。意义： DSCM中Wnt5a作为关键作用分子，具有促进SMSCs成软骨分化、抑制软骨细胞肥大化作用，为SMSCs作为种子细胞在治疗半月板损伤中遇到的问题及临床上半月板钙化找到有效的解决方案。