视网膜色素上皮细胞GPI锚定CD73脱落机制的研究

Previously we verified that RPE is the unique cell type expressing CD73 in the retina. Under physiological conditions CD73 was widely distributed on the membrane of RPE cells, catalyzing AMP to immune suppressive adenosine. When experimental autoimmune uveitis (EAU) was in the presence, RPE cells only express minor CD73, leading to decreased adenosine accumulation and weakened its immune suppressive effect, contributed to the pathogenesis of EAU. Since there is no transmembrane domain in the molecule, CD73 was anchored to the membrane by its carboxy terminal modified glycophosphatidylinositol(GPI). GPI-CD73 complex has the properties of lipid raft, including membrane shift ability and confirmation viability. Meanwhile, we also found that the shedding of CD73 from the surface of RPE cells is matrix-metalloproteinase (MMP) dependent. Taken together we proposed to study in this project (1)Verify the effect of MMP on shedding CD73, find out MMP recognizing and catalyzing site in CD73, and find out whether the shedding is regulated by the confirmation of CD73. (2)Whether there are other factors, such as adenosine receptor or MMP, could bind with CD73 to form more complicated complex besides CD73 and GPI. (3)Forcing the presentation of CD73 on the membrane of RPE cells to cure EAU.

视网膜色素上皮细胞（RPE）膜表面分布有CD73分子，酶解AMP至具有免疫抑制功能的腺苷。当实验性自身免疫色素膜炎（EAU）发生时，RPE转为CD73阴性，降低局部腺苷浓度，对自身免疫反应的抑制作用减弱而促发EAU。CD73分子本身无跨膜结构域，是通过其羧基端所修饰的糖磷脂酰肌醇(GPI)而锚定于细胞膜上。CD73-GPI复合体拥有脂筏的特点，即膜移动性及构象可变性。我们还发现CD73自RPE表面的脱落由基质金属蛋白酶（MMP）的水解作用所介导。据此，提出本课题的研究设想：1）明确MMP对CD73脱落的催化作用，确定出MMP识别、水解CD73的位点及水解作用是否依赖于配体或底物的存在。2）寻找CD73的辅助结合分子，是否同腺苷受体存在着结合，此结合是否受到CD73构象的影响，对CD73的脱落有何作用？3）通过对CD73分子的改造或修饰实现CD73在RPE表面的持续存在，缓解自身免疫性眼病。

CD73可将AMP分解为腺苷，是控制细胞外腺苷产生的限速酶。由于腺苷具有重要的免疫抑制作用，CD73的含量变化也会对局部炎症产生重要的影响。我们早期发现视网膜色素上皮细胞（RPE）在生理状态下高表达CD73，发挥免疫抑制功能。但当眼底炎症存在时RPE表面CD73的含量急剧降低，免疫抑制功能减弱，利于眼底炎症的发生。本课题着眼于RPE表面CD73脱落机制的研究，以期为自身免疫性眼底疾病的治疗提供新的靶点。首先，利用选择性拮抗剂及RNAi技术我们分析出是基质金属蛋白酶家族（MMPs）中的MMP-9亚型水解CD73分子中的K547-F548位点，使其自RPE表面脱落。MMP-9可以识别并水解CD73依赖于CD73与另一分子，既腺苷受体A1亚型（ARA1），形成CD73/ARA1复合体。该复合体的形成可由炎症因子所诱导。某些炎症因子，如脂多糖（LPS）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）可诱导RPE细胞表面形成脂筏，并将CD73位于其中。脂筏赋予CD73膜流动性使其可以与ARA1相接触而形成CD73/ARA1复合体。此外，为了明了是否CD73在其他细胞中也具有与RPE相似的免疫调节作用，我们将研究内容扩展至与RPE细胞类型相似的星形胶质细胞。结果表明，CD73在星形胶质细胞中具有与RPE细胞非常相似的作用，也可通过自身含量的变化而调节免疫反应。最后，我们还利用MMP-9抑制剂对实验性自身免疫色素膜炎（EAU）进行了常识性治疗。体内给予MMP-9抑制剂可有效阻断RPE表面CD73的脱落，从而产生对EAU的防治作用。该研究成果有助于为自身免疫性色素膜炎和其他自身免疫性疾病的治疗提供新的依据。