水稻抗稻瘟病相关基因Ptr(t)的克隆与功能研究

稻瘟病严重影响我国乃至全世界水稻产量。对水稻抗稻瘟病相关基因的研究，不仅可以阐明水稻抗稻瘟病的机制，还可以通过基因操作技术培育具有广谱、持久抗稻瘟病的水稻新资源。本项目以水稻抗稻瘟病相关基因缺陷型突变体为研究材料，在将突变基因ptr(t)精细定位在50kb区域的基础上，拟利用图位克隆技术获得Ptr(t)候选基因，通过互补试验和基因过表达技术验证基因功能，利用cDNA芯片进行表达谱分析，综合运用亚细胞定位、启动子分析、qRT-PCR及诱导抗性鉴定基因的表达模式，全面揭示Ptr(t)基因的功能，剖析其调控抗病过程的机理，同时为通过基因操作技术获得抗稻瘟病的水稻新品种提供理论与实践依据。

本项目利用图位克隆法从水稻第12号染色体上克隆了一个新颖的抗稻瘟病相关基因OsPtr(t)，并对该基因的功能开展了系统研究。项目构建了OsPtr(t)基因的遗传互补载体和人工小RNA载体，并通过农杆菌介导方法将上述重组载体分别导入感病亲本L172和抗病亲本Katy的愈伤组织中，获得稳定遗传的转基因T2植株。接种鉴定显示，L172互补OsPtr(t)基因的T2植株抗性增强，而Katy经OsPtr(t)-amiRNA干扰后，植株表现为感病，表明OsPtr(t)基因的确参与水稻抗稻瘟病的过程。将构建的OsPtr(t)基因的过表达载体通过农杆菌介导法导入日本晴和Katy中，观察其对其它生物胁迫如飞虱等的应答，发现日本晴的OsPtr(t)过表达转基因T1代植株能够提高对褐飞虱的抗性。生物信息学分析表明OsPtr(t)基因末端存在细胞核定位信号，我们采用PEG介导的原生质体转化法，将OsPtr(t)-YFP融合表达载体在水稻原生质体内瞬时表达，激光共聚焦显微镜观察表明OsPtr(t)蛋白定位于细胞核内。.为了进一步研究OsPtr(t)基因参与的抗病信号通路，阐明水稻抗病分子机制，我们利用RNA-seq法获得了Katy及其快中子突变体M2354 (ptrt)稻瘟病接种前后差异表达的基因，开展了相关生物信息学分析，发现Katy和M2354接种前后差异表达的基因主要富集在以下KEGG pathways上：植物-病原互作，植物激素信号转导，苯丙素合成，苯丙氨酸代谢，外芪类化合物、二芳基庚醇及姜辣素合成，帖类物质合成， 柠檬烯和蒎烯降解，氨基糖和核酸糖代谢。暗示这些物质代谢通路可能与水稻基础抗病相关；进一步比较分析Katy和M2354接前后差异基因的数据表达谱，发现两者间差异表达基因显著富集在维生素C代谢，蓓半萜和三萜合成，油菜素内酯合成，黄酮与黄酮醇合成，外芪类化合物、二芳基庚醇及姜辣素合成，柠檬烯和蒎烯降解以及苯丙素合成等代谢通路上，为深入研究OsPtr(t)基因的生物学功能提供了线索。研究结果不仅丰富了水稻抗稻瘟病的分子理论机制，也为抗稻瘟病水稻品种的选育提供了新材料。