斑马鱼肠发育的遗传学与基因组学研究

The intestine is an important digestive organ. It is useful to study the intestine development to understand diseases and birth defects related to the intestine in human. Molecular mechanisms of organogenesis among vertebrates are conserved, and results from zebrafish intestine development can be applied to human. To systematically investigate regulatory genes involved in the zebrafsih intestine development; we propose to use both genetic and genomic methods. We are carrying out a classic ENU forward genetic screen for zebrafish intestine mutants to identify genes responsible for the intestine development without gene bias. At the same time, we also perform RNA-seq to investigate transcriptomes of the intestine in adults and embryos, and try to discover specific genes expressed in the intestine, then to study functions of these genes by gene knock-out to generate loss -of -function mutants. We have finished genetic screen of 148 mutagenized genomes and harvested 22 mutants belonging to 3 groups according to phenotypes. We have also collected RNA-seq data of five segments of the adult intestine and the whole intestine in adults and 5dpf embryos. Bioinformatics analyses have identified 6 clads of gene with specific expression patterns in the five segments of the adult intestine and remaining body. These fundamental works have built up a solid foundation for the whole project. By performing the project, we are hoping to finish a screen of 400-500 mutagenized genomes and study 2-3 mutants, identify specific expression genes in the zebrafish intestine and knock-out 4-5 interesting genes. Our study is expected to identify novel molecular mechanisms of the zebrafish intestine development.

肠是重要的消化器官，研究肠的发育有助于增强对肠相关疾病及出生缺陷的理解。脊椎动物器官发育的机制是保守的，研究斑马鱼肠发育可为人类肠发育提供借鉴。本项目将结合使用遗传学和基因组学方法，系统地研究斑马鱼肠发育的调控基因及机制。我们将开展经典的ENU突变体正向遗传筛选，无基因歧视地鉴定斑马鱼肠发育调控基因；同时我们将通过转录组测序，高效地发掘肠特异性表达基因，通过基因敲除的方法建立突变体并研究其功能与机制。目前，我们已筛选了148个突变基因组，获得了三类共22个肠发育突变体；完成了成鱼全肠及不同节段、胚胎期肠的转录组测序，成鱼肠不同节段的数据分析鉴定了6个组织特异性表达基因簇。这些工作为项目的实施奠定了坚实的基础。我们预期完成400-500个突变基因组的筛选，深入研究2-3个突变体；通过转录组分析鉴定斑马鱼肠特异性表达基因谱，敲除4-5个基因并研究其机制。我们预期可以发现未曾报道的肠发育调控机制。

遗传筛选是系统研究器官发育的有效方法，我们在ENU诱变的斑马鱼中开展了两个消化器官发育缺陷突变体筛选，运用组织特异性标记，我们从276个突变基因组出发，经F2筛选和4-5次传代，获得了稳定遗传的36个突变体。根据表型这些突变体可分为三类：肠特异型、肝脏特异性、肠和肝脏发育缺陷，其中第三类突变体占总数的绝大多数，说明肠和肝脏的发育调控机制大部分是相同的。通过图位克隆，我们发现V9A突变体的致变基因是一个在胚胎期富集表达于消化器官的基因iars，此基因的突变可导致人类疾病，且总是一个强突变和一个弱突变的组合。我们通过CRISPR/Cas9技术建立了一个强突变，并与V9A这一弱突变一起分析比较了的消化器官表型，发现两种突变都可导致消化器官细胞周期受损，影响消化器官长大，且强突变的表型总较弱突变明显。通过图位克隆我们鉴定了V28A突变体中的致变基因是gspt1l，此基因富集表达于胚胎期消化器官，突变不影响消化器官起始出芽，但是阻碍芽体生长，这是由于突变体细胞周期受阻。此外，突变体中UPR反应增强，并导致突变体肝细胞分化推迟。通过转录组测序分析，我们鉴定了在斑马鱼成年肠不同节段中6种不同表达模式的基因归类，获得了一批在肠不同节段富集表达的基因。运用CRISPR/Cas9技术，我们敲除了5个可能与消化器官发育相关的基因，包括Hippo信号通路的效应分子Yap1和Taz。我们的研究发现，Taz在yap1突变体中上调，其机制与哺乳动物相似。单基因敲除的yap1和taz突变体无胚胎期表型，yap1-/-;taz+/-胚胎表现出小肝脏或双小肝脏的表型，其外分泌胰腺也与肝脏类似，而肠则表现为未弯曲的直形。进一步研究发现Taz协同Yap1以Tead依赖的方式调控斑马鱼肝脏发育，其作用方式是促进肝细胞增殖和保证侧板中胚层的迁移。.我们的研究获得了36个消化器官发育突变体，是后续研究的重要材料；较为深入地研究了2个突变体；鉴定了大量肠不同节段特异性基因；敲除了5个基因，发现了Yap1/Taz在斑马鱼消化器官发育中的功能。我们共发表3篇论文，其中2篇为SCI。