斑马鱼Brd3b调控消化器官发育的分子机制研究

Digestive organs play essential roles in human body, and studies of development of digestive organs implicate clinic applications. The conserved molecular mechanisms and powerful genetics of zebrafish make it as an ideal animal model to study digestive organogenesis.Brd3b, a member of BET (bromodomains and extraterminal) family, has two functionally conserved bromodomains, which can recognize and bind to acetyl lysine residues in histones to regulate downstream gene expression. brd3b was identified in our lab as a digestive organ enriched factor in an EST expression pattern screen. Morphants wiped out brd3b have severe defects in digestive organogenesis. Brd3b was also found to interact with Def, another digestive organs enriched nuclear factor. To elucidate the molecular mechanism of Brd3b in digestive organogenesis, we propose to perform studies in two ways: developmental study and molecular mechanism study. To obtain brd3b mutant line, the TALEN method will be used, and phenotype characterization will be performed in mutant lines. To identify target genes of Brd3b, ChIP-PCR will be used to test the candidate genes from Brd3b ChIP-Seq and RNA-Seq of mutant via siblings. Of course, those Brd3b target genes will be functional analyzed by gene knock-down or mRNA overexpression in brd3b mutants. We also want to figure out the role of Def in Brd3b binding to chromatin.

消化器官是人体内的重要器官，研究消化器官发育对于进一步认识临床疾病、创新治疗方法有着重要意义。保守的分子机制和多样化的遗传手段使得斑马鱼成为理想的研究消化器官发育的模式动物。Brd3可特异性识别乙酰化组蛋白而调控基因表达，brd3b是我们鉴定的一个富集于斑马鱼胚胎消化器官内表达的基因，它在消化器官发育中的功能未见报道。敲降此基因的表达导致斑马鱼胚胎消化器官的发育严重缺陷，蛋白共沉淀的结果显示Brd3b与先前报道的另一消化器官富集因子核仁蛋白Def 有交互作用。本课题拟通过以下实验研究brd3b基因在消化器官发育中的功能与分子机制：1）TALEN法建立brd3b突变体，2）brd3b基因缺陷导致的消化器官发育缺陷的表型分析，3）Brd3b与Def的关系研究，4）Brd3b抗体染色质免疫共沉淀候选基因的鉴定，5）Brd3b调控的靶基因的鉴定，6）Brd3b靶基因在消化器官发育中的功能研究。

前期的研究表明brd3b基因在斑马鱼胚胎消化器官中富集表达，morpholino敲降brd3b表达可导致消化器官发育缺陷，本项目拟通过建立遗传突变体及Chip-seq研究其调控消化器官发育的功能和机制。运用TALEN和CRISPER/Cas9技术，我们成功地构建了斑马鱼brd3b和brd3a的突变体及双基因突变体，然而并未发现突变体存在任何消化器官发育缺陷；利用原核表达并亲和层析纯化的Brd3b蛋白免疫家兔，我们获得了可检测内源性蛋白的抗体；我们还克隆了斑马鱼brd3b基因的启动子并构建了转基因斑马鱼。由于突变体没有表现消化器官发育缺陷的表型，因此此项目的研究内容没有继续，转而研究了另一个消化器官富集表达的基因ltv1。. 细胞核糖体生成是一个普遍而又重要的过程，核糖体生成过程被破坏会影响机体的发育，在人类中则会导致一系列的病症，称之为核糖体病。酵母、果蝇和人类细胞系中的研究表明Ltv1参与40s核糖体亚基的合成，但是它在脊椎动物中的功能研究尚未见报道。我们利用CRISPR/Cas9技术，获得了斑马鱼ltv1（Ltv1蛋白是一种非核糖体蛋白）突变体，并发现ltv1突变隐性致死且ltv1参与18s rRNA的生成。ltv1-/-斑马鱼突变体胚胎会表现出颅面骨骼异常，胰腺，肝脏，肠道发育不良，以及造血干细胞前体细胞（HSPCs），红细胞，淋巴细胞和髓系细胞的减少。突变体的外分泌胰腺和永久造血缺陷分别是由于ptf1a+前体细胞和runx1+ HSPCs的增殖减少导致的，而不是细胞凋亡。很多研究表明P53激活是核糖体病的致病机制之一，在ltv1-/-斑马鱼突变体中敲降p53并不能挽救突变体的发育缺陷。由于ltv1-/-斑马鱼突变体的表型与Shwachman-Bodian-Diamond综合症有很多相似之处，我们的研究成功地构建了一个新的非P53依赖的核糖体病动物模型。.