一个E3 泛素蛋白连接酶调控水稻叶绿体发育研究

水稻叶色突变体，是研究单子叶植物叶绿体结构、功能和发育的理想材料；还可以作为标记性状，简化良种繁育，提高杂交种种子纯度，提供优良的种质资源。我们的项目根据拟南芥叶片衰老响应基因的芯片分析结果，寻找同源的水稻基因及相应的突变体，发现了一个具有叶色白化的突变体la1。通过Tail-PCR初步确定T-DNA插在一个E3 泛素蛋白连接酶上。本研究将利用这个T-DNA 插入的突变体材料，通过其遗传规律、光合特性、突变基因及其功能研究，以期从植物生理和分子水平阐明突变体的突变机理，深入了解单子叶植物叶色突变的发生机制，为其在水稻光合生理、功能基因组研究及生产等方面的应用提供重要的理论依据。此外，对泛素化蛋白修饰在水稻发育中的作用和调控机理进行深入分析，以期能在分子水平阐明泛素化蛋白修饰对水稻器官发育调控的分子机理，并初步建立调控可能的分子模式，为改善水稻产量等重要农艺性状提供分子育种和遗传改良的依据。

众所周知，水稻叶色突变体，是研究单子叶植物叶绿体结构、功能和发育的理想材料；还可以作为标记性状，简化良种繁育，提高杂交种种子纯度，提供优良的种质资源。我们的项目根据拟南芥叶片衰老响应基因的芯片分析结果，寻找同源的水稻基因及相应的突变体，从PFG购买了一个具有叶色白化的突变体la1。通过Tail-PCR初步确定T-DNA插在一个E3 泛素蛋白连接酶上。通过Real-time PCR分析突变体中LA1基因的表达，发现la1是LA1的knock out 突变体；构建不同的植物表达载体，其中构建LA1的过表达载体转化野生型水稻，通过抗性筛选获得了23株独立的转基因株系；构建LA1的RNAi载体转化野生型水稻，通过抗性筛选获得了26株独立的转基因株系，但是表型分析没有发现明显差异。构建LA1的互补载体，通过农杆菌转化进行la1突变体的互补研究，由于la1突变体表型过于强烈，纯合突变体致死，杂合突变系的育性也受到一定程度的影响，收到的种子较少，给后续的互补工作带来一定的难度。我们采取的补救措施：我们订购了la1突变体的等位突变体，找到表性较为温和的突变体la1-2。la1-2突变体叶色黄化，能收到少许的种子。透射电镜进行叶绿体结构分析表明：野生型植株突变体内具有良好的基粒类囊体与基质类囊体；la1-2突变体叶绿体数目变少，体积变小，有少量片层膜结构；la1突变体中几乎完全丧失叶绿体。构建LA1不同的植物表达载体，转化水稻没有明显表型，我们在拟南芥中进行了相应研究，发现LA1的过表达载体转化拟南芥，发现相应的转化植株出现叶和茎呈现亮绿色，扫描电镜发现其蜡质晶体数目减少，叶片失水较慢，植株叶绿素不容易萃取，角质层透性变化；通过GC-MS初步分析转基因植株中蜡质含量明显减少，通过Real-time PCR方法研究蜡质合成相关基因的表达，发现相应基因表达降低。这在E3 泛素蛋白连接酶在植物发育中的作用和调控机理研究具有深刻意义。