共刺激分子B7-H3在骨肉瘤免疫逃逸中的作用及机制研究

The inhibitory-signal mediated by costimulatory molecules plays important roles in T cell activation, differentiation and regulating its functions. B7-H3 is one of newly identified B7 family costimulatory molecules. Our preliminary studies showed that B7-H3 was overexpressed in human osteosarcoma tissues and associated with the clinicopathological factors and prognosis of patients. Moreover, tumor B7-H3 expression inversely correlated with the number of tumor-infiltrating CD8+ T cells, suggesting that B7-H3 might play an important role in escaping immunosurveillance of osteosarcoma by interacting with its receptor, or through induction of immunosuppressive immune cells in tumor microenvironment. However, the specific mechanism is still far from elucidated. Therefore, in this study, an expanded osteosarcoma study cohort from different immune status patients was established to investigate that how B7-H3 induce different infiltrating immune cells' surface molecule expression changes in tumor microenvironment and how to regulate these cells' functions in affecting tumor-specific T cell immune response. Furthermore, immune function of tumor-specific T lymphocytes was observed by blocking B7-H3/B7-H3CR signaling pathways. In conclusion, this study was aim to explore the mechanism of T cell exhaustion and clarify the possible mechanism of immune escape of osteosarcoma, which offered for search of the diagnosis bio-marker and provided new targets of potential application value for improving immunological therapy of osteosarcoma.

共刺激分子介导的抑制信号对T细胞的活化、分化及功能起决定性的调控作用。B7-H3是新鉴定的共刺激分子之一。我们前期研究发现，B7-H3在骨肉瘤组织中表达异常增加，与患者的临床病理因素和预后显著相关，并与肿瘤组织中CD8+T淋巴细胞浸润的程度呈负相关，提示B7-H3可能通过与其受体结合、或诱导肿瘤微环境中免疫抑制细胞对CD8+T细胞发挥负调控的作用，导致肿瘤免疫逃逸的发生，但具体的作用机制还远未阐明。因此，本课题拟扩大病例建立不同免疫状态的骨肉瘤研究队列，首次研究B7-H3分子在骨肉瘤细胞表面过度表达后对肿瘤微环境中不同免疫细胞表面分子表达谱的影响，探索阻断B7-H3/B7-H3CR信号途径对肿瘤特异性T淋巴细胞免疫功能的直接和间接的影响，进而揭示骨肉瘤进展过程中T细胞功能衰竭的分子机制，有助于阐明导致骨肉瘤免疫逃逸的可能机制，进而为提出评价骨肉瘤疾病进展、改善骨肉瘤免疫治疗提供新的靶点。

B7家族共刺激分子对T细胞的活化、增殖和分化起重要的调控作用，在抗肿瘤免疫中扮演关键角色。本课题通过研究共刺激分子B7-H3在骨肉瘤中的表达特点，进一步探讨其在肿瘤微环境的免疫逃逸作用及相关调控机制。主要研究内容及结果如下：1.研究通过回顾性调查61例骨肉瘤患者B7-H3的表达，发现B7-H3阳性表达59例，阳性率为93.65%。B7-H3分子主要定位于骨肉瘤细胞的细胞质和细胞膜。B7-H3阳性表达率与与患者Ennecking分期、是否发生肺转移之间的具有相关性。通过随访患者生存资料发现，B7-H3高表达者总体生存率明显低于低表达者。2.骨肉瘤组织中B7-H3的表达水平和CD8+T淋巴细胞浸润程度呈负相关，提示B7-H3分子可能促进了肿瘤细胞的免疫逃逸。3.沉默骨肉瘤细胞中B7-H3基因表达后，MG-63细胞的侵袭力明显下降，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)分子的表达水平显著下降。相反，上调B7-H3基因表达后，骨肉瘤细胞Saos-2细胞的侵袭力明显增加，证实B7-H3分子参与并可能促进骨肉瘤细胞的侵袭转移。4.利用生物信息学及组织芯片验证，发现miR-124的表达水平在骨肉瘤组织中表达显著下调，并可直接结合在B7-H3基因的3’UTR区负调该基因的表达。外源性转染miR-124 mimics入骨肉瘤MG-63细胞，MG-63细胞的活性受到显著的抑制，在此过程中，细胞活性相关蛋白PCNA和Cyclin D1分子的表达显著受到抑制，凋亡蛋白PARP显著增加。转染miR-124 mimics可以显著抑制MG-63细胞的侵袭能力，MMP-9蛋白和vimentin分子表达下调；上皮细胞标记物E-cadherin表达显著增加；5.利用CRISPR/Cas9技术敲除MG-63细胞中B7-H3基因的表达，建立稳定缺失B7-H3基因表达的骨肉瘤细胞株（B7-H3 KO），研究野生型WT细胞和KO细胞circRNA表达谱和细胞因子分泌谱的变化，发现38个相关的细胞因子及趋化因子发生了显著变化。本课题研究发现，非编码miR-124可在骨肉瘤细胞中通过与B7-H3分子结合实现对其表达的调控，并可通过改变B7-H3分子的表达对肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭等生物学功能发挥作用，并可进一步影响骨肉瘤细胞的细胞因子表达谱，提示miR-124/B7-H3在调节骨肉瘤转移过程中发挥重要作用。