阈值下预照射的半导体激光治疗CNV的基础和临床研究

脉络膜新生血管（CNV）形成及伴发的视网膜下出血、渗出和疤痕形成等是导致年龄相关性黄斑变性和病理性近视视力下降的主要原因。目前尚缺乏安全、有效、又符合中国国情的治疗方法。低功率、大光斑、长曝光时间的半导体激光（DL）治疗CNV已被临床证实具有良好应用前景。DL封闭CNV同时对病灶周围组织的损伤是该治疗的不足之处。申请人的前期工作显示：阈值下DL预照射可诱导人脐静脉血管内皮细胞或大鼠视网膜Hsp70高表达，使血管内皮细胞坏死减少，神经视网膜组织细胞凋亡下降。提示：阈值下DL预照射对被照射细胞或组织有保护作用。本课题拟通过对联合阈值下DL预照射的人脉络膜血管内皮细胞、大鼠CNV模型视网膜进行组织病理和分子生物学检测，探讨阈值下DL预照射的作用，阐述联合阈值下预照射提高DL治疗CNV的安全性和有效性的机理，并将预照射概念应用于临床治疗，探索DL治疗CNV的更优化方案。

本研究采用不同功率810 nm半导体激光照射体外培养的猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A），观察照射后细胞形态，Annexin V-FITC和PI法检测细胞活力及确定造成细胞损伤的激光能量阈值，并分别在激光照射后6，12，18，24和48 h检测细胞Hsp70的表达；然后将RF/6A细胞分组，进行高能量激光照射前给予或不给予阈值下激光预照射，照射后观察细胞形态，检测细胞活力、细胞凋亡和Hsp70和活化caspase 3的表达。结果发现：激光造成RF/6A细胞损伤的阈值功率为1100 mW（能量密度84.08 J/cm2），应用低于此能量的激光照射后，Hsp70表达明显升高，以600 ~ 1000 mW（能量密度45.86 ~ 76.43 J/cm2）最为显著。Hsp70在照射后12 h达到高峰并持续至18 h，24 h后逐渐降低。Hsp70在胞浆和胞核中均明显表达。RF/6A细胞在高能量激光照射前给予或不给予阈值下预照射其细胞存活率均显著下降，但前者大多呈凋亡形态，可见大量TUNEL阳性细胞，活化caspase 3表达；而后者细胞大多坏死；western blot检测显示前者细胞Hsp70的表达明显高于后者。提示半导体激光阈值下照射可以诱导RF/6A细胞Hsp70高表达；阈值下预照射联合高能量激光照射可通过Hsp70高表达使细胞发生凋亡而避免坏死。.通过对BN大鼠视网膜下腔注射Matrigel或PBS 2 µl，分别在注射后3天和1、2、3、4、5、6周进行眼底照相、FFA、OCT和组织病理学检查。结果发现：注射Matrigel后1周，见RPE细胞离开Bruch’s膜向光感受器层迁移；注射后2周，RPE下新生血管形成，OCT检查显示神经上皮下局部中高反射伴局部神经上皮脱离；注射后3周，FFA在远离注射点出现荧光素渗漏；注射后4周，FFA渗漏持续存在，局部出现视网膜深层出血；注射后6周，视网膜出血吸收，FFA显示仍有渗漏。显示CNV造模成功。.用不同功率的半导体激光（50，60，70，80，90，100mw）照射大鼠CNV处，检测视网膜Hsp70及BAX/BCL2的表达。结果发现Hsp70表达随着激光能量增加而增加，激光能量90mw时Hsp70表达最高，BAX/BCL2在激光能量70mw时最大。再次证实升高Hsp70可以保护视网膜组织。