受MicroRNA调控的重组EV71在恶性神经胶质瘤模型上的溶瘤研究

Malignant gliomas are the most fatal primary tumors of the central nervous system. Clinically, malignant gliomas are extremely resistant to all currently approved therapies, including surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy. Therefore, oncolytic viruses have been investigated as a novel and promising treatment modality, either alone or in conjunction with other modes of therapy. In previous studies, we show that wild type enterovirus 71 (EV71) can infect and propagate in cell lines derived from malignant gliomas, while primary glial cells somewhat display resistance to EV71-mediated cytotoxicity. Accordingly, we will employ EV71 harboring potent and specific cytolytic activity as a candidate virus for oncolytic virotherapy against malignant gliomas. Firstly, the contributions of expression levels of surface receptors and caspase-mediated apoptosis to EV71-mediated oncolysis on glioblastoma cells will be explored. To ensure that efficacy can be maximized without risking oncolytic EV71 replication in nontarget brain, tissue-specific expression of cellular miRNAs will be exploited. Recombinant EV71 will be constructed to contain neuron-specific miRNA target sequence insertions in 3’ UTR without adverse effects to virus replication. After confirming the neuroattenuated phenotype, the oncolytic potential of recombinant EV71 will be measured in both malignant glioma cell cultures and xenografts. This project will add a potential new member in the arsenal for treatment of human malignant gliomas and establish a miRNA-based approach to enhance tumor specificity of virotherapeutics.

脑部原发性肿瘤中，恶性胶质瘤的发病率最高，患者生存期短、死亡率高。通过手术、放疗、化疗等传统方法治疗后，不能显著延长患者的生存期，因此迫切需要寻找新的治疗方法。近年来，利用肿瘤杀伤型溶瘤病毒，针对恶性胶质瘤进行了单独或联合治疗的探索性研究，结果表明这一方法具有较好的潜在疗效。我们的前期工作发现，EV71对恶性神经胶质瘤细胞具有较强的选择性溶瘤作用。本项目将首先解析EV71介导的溶瘤反应与病毒受体、细胞凋亡的关系，明确抗瘤能力的相关机制。随后，利用肿瘤和正常组织中特定miRNA的差异表达特性，我们将构建受神经组织高表达miRNA调控的EV71重组病毒，并在恶性神经胶质瘤细胞单层、多细胞球体和异种移植小鼠模型上检测重组病毒的溶瘤效果。本研究将建立一种具有选择性溶瘤能力的新型肠道病毒，扩展可利用的溶瘤病毒资源库，提高溶瘤病毒治疗的特异性和安全性。

恶性胶质瘤在成人原发性脑部肿瘤中最为高发，且肿瘤迁移性较强、肿瘤细胞增殖速度较快、患者病死率较高。目前临床上针对恶性胶质瘤的常规治疗方法包括手术切除、放疗、化疗以及上述方法的配合治疗等，但治疗效果往往非常有限，导致恶性胶质瘤患者的平均生存期仅为12至18个月。因此，需要开展针对恶性胶质瘤替代治疗方法的研究工作。溶瘤病毒是一类具有特异性靶向杀伤肿瘤细胞能力，并易于进行基因改造的新型肿瘤治疗工具。本课题主要研究利用肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）靶向治疗实验性人恶性胶质瘤。研究发现，在体外细胞模型上，EV71可有效诱导针对恶性胶质瘤细胞单层的溶瘤反应。病毒受体SCARB2和细胞凋亡反应与病毒引起的溶瘤反应有关。利用恶性胶质瘤细胞U87形成的三维肿瘤细胞球体，在更接近实体瘤的体外模型上亦证实了EV71可以有效破坏肿瘤细胞球，显著降低其细胞活性。在皮下U87荷瘤小鼠模型上，EV71瘤体内注射可显著抑制肿瘤生长（P= 0.00015）。在观察期内，阴性对照组的小鼠死亡率为100%，而EV71治疗组则未出现因恶性肿瘤导致死亡情况。通过免疫组织化学检测，发现在EV71治疗25天后，仍能够在瘤体内有效复制。通过TUNEL检测组织细胞凋亡，发现病毒在活体水平亦能有效诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡反应。利用EV71的反向遗传学操作系统，我们成功构建了基因组中插入miR124靶序列的重组病毒。利用miR124在胶质瘤低表达和正常脑组织中高表达的表达丰度差异，能够有效消除重组EV71溶瘤病毒的潜在神经毒性，同时对病毒在恶性胶质瘤上的溶瘤效果没有影响。综上所述，我们发现重组EV71病毒具有较好的溶瘤能力，是一种新型的治靶向恶性胶质瘤的溶瘤病毒。.　　利用胶质瘤细胞模型，我们研究了高生物安全等级病原，蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV）在神经组织来源细胞上的感染特性。在TBEV诱导神经炎症反应的分子机制研究中，利用具有一定免疫功能的胶质瘤细胞，解析了病毒可通过激活转录因子IRF3，有效诱导神经趋化因子RANTES的高水平表达，参与病毒感染引起的神经病理反应。