上皮-间质转化在肝前体细胞组织学发生中作用的研究

Several problems need to be addressed before the performance of hepatic progenitor cells (HPCs)-based clinical trial. The histogenesis of HPCs is one of the most notable controversies. Neither the residual hepatic stem cell-derived hypothesis nor the hematopoietic stem cell-derived hypothesis interprets the biological behavior of HPCs very well. Based on published literatures and our findings, we postulate that HPCs represent a transitioning cell population undergoing epithelia-mesenchymal transition (EMT).HPCs are isolated from patients with HBV-related diseases (hepatitis and cirrhosis) and choline-deficient ethionine-supplemented (CDE) murine model. The expression level of EMT-associated genes in HPC are tested by using double immunofluorescence labeling and RT-PCR. Primary HPCs, hepatocytes and intrahepatic biliary epithelial cells (IBECs) are derived from digested liver and cultured with medium containg transforming growth factor-β (TGF-β). Matrigel invasion chamber are seeded with these simulated cells to compare the mobility. A part of these cultured cells are transplanted to established CCL4 murine model to further investigate the effect on liver regeneration and fibrosis. This project is aimed to explore the possibility that EMT contributes to the histogenesis of HPCs and provides theory foundation for HPC-based therapeutic strategy.

基于肝前体细胞（HPCs）的治疗策略在用于临床实验前仍存诸多难题，它的组织学发生机制是其中最重要也是最具争议的一个。胚胎干细胞和骨髓造血干细胞来源假说都不能很好的阐述HPCs的生物学行为。结合现有证据及本课题组前期研究结果，我们提出全新的HPC组织学发生假说：HPCs代表一类正在进行上皮-间质转化（EMT）的细胞。本项目通过激光捕获显微切割获得并检测人乙肝相关肝病和小鼠CDE卵圆细胞模型组织中HPCs与EMT相关标记物表达关系，并通过TGF-β培养体外分离的HPCs、肝细胞和胆管上皮细胞，观察三者形态及免疫表型的改变和异同点。并将上述细胞移植到CCL4急慢性肝损伤小鼠模型，观察它们对肝修复及纤维化的影响。本项目旨在探索EMT参与HPCs发生的可能性及调控机制，为HPCs调控的分子机制研究及细胞治疗策略奠定理论依据。

项目的背景：终末期乙肝相关肝病（肝硬化及肝癌）的治疗缺乏有效手段。肝前体细胞（HPCs）的发现为临床治疗提供了全新思路，但仍然面临诸多难题。其组织学发生机制是其中最重要也是最具争议的一个。越来越多的研究结果表明上皮-间质转化（ EMT）可能在HPC组织学发生中发挥重要作用。胆碱缺乏-乙硫氨酸(CDE)小鼠模型造模第3天即出现肝星状细胞活化和I型胶原沉积，至第7天才检测到HPC增殖，说明特定的间质环境可能是HPC活化的前提。HPC还能过度表达与纤维化关系密切的neurexin家族成员：CNTNAP2。其次，处于特定阶段的HPC能表达间质细胞标记物，并且将其植入慢性损伤的肝脏后，可使修复速度显著增加15。而转化生长因子β（transforming growth factor-beta1, TGF-β）能促使体外培养的成体肝细胞和胆管上皮细胞发生特征性的EMT形态和基因表型的改变（1.细胞粘附性下降；2.上皮标记物表达下降且间质标记物表达上升）。与此同时，在这些细胞内还可检测到HPC标记物的表达。基于前期研究结果，我们提出全新假说：HPC代表的是一群正在进行EMT或逆转过程(MET）的细胞。.主要研究内容：A. 利用双重免疫荧光标记观察EMT的发生与HPC的活化是否有时间及空间上的关联性；不同时期HPC内EMT相关标记物的表达变化是否与EMT特性吻合；B. 透射电镜探查组织中HPC与周围上皮细胞或间质细胞是否存在直接空间关系；C. 通过体外TGF-β细胞培养，观察HPC、肝细胞和胆管上皮细胞能否具有间质细胞形态、迁徙能力及免疫表型，EMT相关标记物表达变化情况是否与经典EMT理论吻合；D. 经过TGF-β培养的HPC、肝细胞和胆管上皮细胞移植入急慢性肝损伤模型后，对肝脏修复及纤维化的发生是否能起到不同的作用。.重要结果：A.证实在乙肝相关肝病中，HPC与胆管上皮细胞及中间型肝细胞存在直接连接；B.证实在乙肝相关肝病中，HPC内EMT相关标记物表达与其增殖有密切关系。.关键数据及其科学意义：A.电镜显示HPC与胆管细胞和中间型肝细胞有直接的连接，表明HPC可能代表一种出于成熟胆管细胞和肝细胞之间的状态；B.胆管上皮细胞内EMT和HPC标记物的表达具有密切联系，表明炎症可能促使胆管上皮细胞发生EMT转变。