ArgR-Mcm1转录复合物对丝状真菌Podospora anserina子实体发育调控机制的研究

Fruiting-body is a vital organ of filamentous fungus for sexual reproduction, but regulatory mechanism of its development is not fully clear. Our previous studies have shown that two mutated genes, PaArg82 and PaMcm1, in ArgR-Mcm1 complex are involved in the developmental process of fruiting-body, by gene deletion and complementation methods.ΔPaArg82 and ΔPaMcm1 mutants have been constructed.To further reveal the regulatory mechanism of ArgR-Mcm1 complexes to the development of fruiting-body in P.anserina, the other two ArgR-Mcm1 transcriptional complex genes(PaArg80 and PaArg81)will be deleted individually. Multiple mutants will be constructed by genetic crosses. Phenotypic analysis will be made on all the mutants. Expression level of the genes involved in the fruiting bodies formation will be analysed. Cellular localization and expression level of these four genes in the process of fruiting bodies formation will be studied.Key genes with significant difference at expression levels between wild type and mutant strains will be screened by DGE.The downstream key genes of ArgR-Mcm1 transcription complex involved in fruiting-body formation will be identified by gene deletion and mutation analysis. Function of the four ArgR-Mcm1 transcriptional complex genes and the regulation mechanism of fruiting bodies formation mediated by ArgR-Mcm1 transcriptional complex will be explored. Superior fruiting-body development defective strain for industry will also be screened.

子实体是真菌进行有性繁殖的重要器官，丝状真菌子实体的发育调控机制尚未完全研究清楚。我们前期研究显示ArgR-Mcm1复合物（由PaArg80、PaArg81、PaArg82和PaMcm1构成）中的PaArg82和PaMcm1基因参与子实体的发育过程。为了进一步揭示ArgR-Mcm1复合物对丝状真菌P. anserina子实体发育的调控机制，在已经构建的敲除突变体ΔPaArg82和ΔPaMcm1的基础上，进一步敲除基因PaArg80和PaArg81。遗传杂交构建多基因突变体。突变体表型分析，检测子实体发育相关基因的表达情况。分析4基因的表达特征、细胞定位和相互作用。DGE分析野生型和突变体中显著性差异表达的基因，筛选ArgR-Mcm1复合物下游调控子实体发育的关键基因。本研究对阐明ArgR-Mcm1复合物的功能和对子实体发育的调控机制具有重要意义，也有助于筛选出性状优良的子实体缺陷型工业菌株

子实体是高等真菌有性生殖阶段形成的能产生孢子的生殖体，是真菌进行繁殖的重要器官。真菌子实体形成机制还没有完全研究清楚。ArgR-Mcm1转录复合物是酵母调控基因表达的分子开关，由转录因子Arg80、Arg81、Arg82和Mcm1组成。本研究以Podospora anserina为模式生物研究ArgR-Mcm1转录复合物对丝状真菌子实体发育的调控机制。在过去的三年里，本人和团队成员围绕这个课题开展了比较深刻的研究，已经取得一些令人欣慰的成果。本项目完成Arg-Mcm1 复合物中4 个基因所有单重突变体和多重突变体的构建(共15 个)。定量分析了4 基因的表达情况，所有突变体的表型分析。经过对着四个突变体表型分析，发现Arg82是与子实体发育最为密切的一个基因，敲除该基因后，在M2基础培养基和木屑培养基上，突变体ΔPaArg82生长速度都大于野生型菌株，这对该菌的大规模产业化应用是一个很好的结果。ΔPaArg82突变体菌丝呈白色，子实体非常小，不能发育为成熟的子囊，无子囊孢子。荧光定量PCR显示该基因在子实体形成和发育阶段表达都量都显著提高。说明该基因确实是在真菌子实体发育中起到关键作用的一个基因。我们还对其他三个突变体ΔPaArg80、ΔPaArg81和ΔPaMcm1进行了更加深入的研究，发现这三个基因和子实体发育相关性不大。成功构建PaArg82绿色荧光蛋白标记菌株PaArg82-gfp。通过对红绿双荧光菌株进行分析，发现PaArg82蛋白定位于细胞核中。我们通过序列比对和进化分析，发现该基因是一个磷酸肌醇激酶基因，相关的文章已经发表在杂志Developmental biology 上面。在对PaArg80、PaArg81序列分析过程中发现他们都是氧化还原酶类基因，他们与多铜氧化酶类基因高度同源。PaArg80是铁氧化酶，PaArg81是抗坏血酸氧化酶，对他们进行单独的表型分析发现他们与子实体的形成关系不大，但是与真菌色素的沉着有关，ΔPaArg80突变体孢子颜色有深绿色变成了浅绿色，ΔPaArg80ΔPaArg81双重突变体的孢子颜色变成了无色。说明这两个基因也与丝状真菌生长发育相关，相关的研究成果发表在杂志Fungal genetics and biology上。