Sumo-1在小鼠卵巢颗粒细胞中的作用和机制研究

哺乳动物卵巢颗粒细胞增殖分化等过程的调控对卵泡发育和卵子发生过程都非常重要。Sumo化是蛋白质翻译后的重要修饰方式之一，在颗粒细胞中的作用和功能调节还不清楚。本课题采用多种方法研究：（1）Sumo-1在卵巢不同级别卵泡中的定位和表达模式；（2）生殖激素（FSH、LH、雌激素或孕酮）对Sumo-1定位和表达的调节；（3）Sumo-1过表达或RNAi后对颗粒细胞的细胞周期、凋亡、染色体分离、细胞核/染色体形态和结构等的影响；（4）过表达后用免疫沉淀和质谱筛选Sumo-1在颗粒细胞中的靶蛋白；（5）Sumo-1的底物及结合位点的鉴定和分析；（6）Sumo-1修饰后对底物的细胞定位、结构或功能的影响及如何参与颗粒细胞功能调节研究。通过研究，揭示Sumo-1对卵巢颗粒细胞增殖、分化和凋亡等过程的调节作用及机理，为进一步了解卵巢卵泡发育及卵巢生殖疾病的发生机理、监控和防治等提供理论依据。

本课题以小鼠为实验动物模型，围绕卵巢中Sumo-1开展了三方面的研究工作。（1）：Sumo-1在卵巢和颗粒细胞中的表达模式、定位规律和功能研究；（2）：颗粒细胞中p53和PTX3的Sumo-1修饰、修饰位点鉴定和功能研究；（3）：Sumo-1在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中的功能研究。研究结果简述如下：Sumo-1在不同发育时期小鼠卵巢组织中具有特异性的时间和空间表达模式。Sumo-1 的表达水平受生殖激素调控，并且对hCG更加敏感，表现为下降趋势。内源性Sumo-1在小鼠颗粒细胞中高表达，定位于细胞核内，然而体外过表达的Sumo-1定位于细胞核和细胞质内，突变Sumo-1的C末端活性氨基酸lys96和lys97后定位仅在颗粒细胞核内检测到，该结果暗示了Sumo-1在细胞质内发挥重要功能。此外，过表达Sumo-1能够显著诱导颗粒细胞凋亡，而过表达突变Lys96和Lys97的Sumo-1后则更为显著性诱导颗粒细胞凋亡，该结果一方面说明Sumo-1对颗粒细胞凋亡有重要作用，也同时暗示其在颗粒细胞中有多种被修饰的靶蛋白，其发挥的功能与其修饰的靶蛋白有密切关系。通过免疫沉淀的方法，我们筛选鉴定了p53b和PTX3为Sumo-1的靶蛋白，同时鉴定了其Sumo 化位点分别是lys375和lys203；p53的Sumo化修饰可以提高p53的稳定性，并且呈剂量依赖性增强；破坏p53的Sumo化位点改变其定位模式，从颗粒细胞核内迁移到细胞质内，同时会显著性降低其促颗粒细胞凋亡的能力；PTX3的定位模式也受其Sumo化修饰调控，破坏PTX3的Sumo化位点，其定位由细胞质转移到细胞核内。此外，通过显微注射特异性SUMO-1 抗体或者siRNA片段的方法，发现Sumo-1对卵母细胞的成熟亦具有重要的调控作用。结果表明抗体或siRNA片段注射后可以对卵母细胞的GVBD和第一极体的排放有一定的抑制作用，卵母细胞表现为纺锤体组装，染色体分离及凝集异常，并且成熟卵母细胞的染色体容易丢失从而形成非整倍体。深入研究后发现抑制SUMO-1功能后纺锤体和着丝粒的结合出现异常，BubR1在着丝粒上的定位减少；REC8在卵母细胞中的表达虽没有变化，但是其在染色体上的定位减少，同时securin在卵母细胞中定位出现异常。综上，本课题的研究结果将为深入理解卵巢颗粒细胞发育和卵母细胞成熟等过程提供理论依据。