ERS在纳米二氧化硅诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡中的作用及分子机制研究

Silica nanoparticles (SPs) have been investigated as both adjuvants and vaccine delivery vehicles. However, few reports concern about the toxicity of SPs, especially reproductive toxicity. SPs can induce follicular atresia and apoptosis of granulosa cells, but the mechanism is still unclear. It has been demonstrated that endoplasmic reticulum stress (ERS) plays a critical role on SPs-induced apoptosis. Therefore, we hypothesize that ERS may participate in the process of follicular atresia and apoptosis of granulosa cells induced by SPs. In this study, the mouse granulosa cells will be used to detect the functions of ERS signaling on SPs-induced apoptosis using immunohistochemistry, inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-MS), western blot, flow cytometry (FCM) and RNAi techniques. (1) The effects of ERS on SPs-induced follicular atresia will be determined in vivo; (2) the roles of ERS on SPs-induced the apoptosis of granulosa cells will be identified in vitro; (3) the exact regulation mechanisms of PERK-eIF2α-ATF4-CHOP-ERO1α signal pathway on SPs-induced apoptosis will be elucidated. These results will provide experimental and theoretical basis for further investigations of reproductive toxicity and nanovaccine application of SPs.

纳米二氧化硅作为载体和佐剂在疫苗研发方面的研究越来越多，但其毒性作用的研究相对较少，尤其是生殖毒性。研究显示，纳米二氧化硅能够诱导卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡，但机制尚不清楚。内质网应激（Endoplasmic reticulum stress, ERS）在纳米二氧化硅诱导细胞毒性方面起到非常重要的作用，因此，我们推测ERS可能参与纳米二氧化硅诱导的卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡过程。本项目以小鼠卵巢颗粒细胞为模型，利用免疫组化、ICP-MS、western blot、流式细胞术及RNAi等方法，通过体内和体外试验检测（1）ERS在纳米二氧化硅诱导卵巢闭锁中的作用；（2）ERS在纳米二氧化硅诱导颗粒细胞凋亡中的作用；（3）PERK-eIF2α-ATF4-CHOP-ERO1α通路在纳米二氧化硅诱导颗粒细胞凋亡中的分子机制；为纳米二氧化硅生殖毒理研究及疫苗研制方面的应用提供实验基础和理论依据。

纳米二氧化硅（Silica nanoparticles, SiNPs）作为医药载体和疫苗佐剂方面的应用越来越多，但其毒性作用及其毒理机制的研究相对较少，尤其是雌性生殖在生殖系统中。研究显示，SiNPs能够诱导卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡，但机制尚不清楚。该项目以小鼠卵巢颗粒细胞为模型检测SiNPs对颗粒细胞凋亡的作用及分子机制。通过CCK-8检测发现SiNPs抑制细胞活力并具有浓度依赖性；利用流式细胞术检测发现SiNPs促进细胞内Ca2+浓度升高以及细胞凋亡并呈现一定的浓度和时间依赖性；利用透射电镜技术发现SiNPs主要位于颗粒细胞细胞质中；利用western blot和qPCR技术检测发现SiNPs上调内质网上PERK和ATF6介导的下游信号通路和内质网Ca2+通道蛋白IP3R1、自噬标志性蛋白LC3-II、BECLIN-1和P62以及凋亡蛋白BAD、cleaved Caspase-3的表达，下调BCL-2表达；同时，利用内质网应激（Endoplasmic reticulum stress, ER stress）抑制剂4-PBA和自噬早期抑制剂3-MA显著降低细胞自噬和凋亡，而自噬激活剂RAP和自噬晚期抑制剂CQ促进细胞凋亡；同时，抑制ATF4、CHOP、ERO1α、BECLIN-1和IPR31表达都能显著降低SiNPs诱导的细胞自噬和凋亡。综上所述，我们发现纳米二氧化硅通过激活内质网应激介导的IP3R1依赖的Ca2+释放促进颗粒细胞发生自噬和凋亡以及诱导颗粒细胞发生自噬并通过抑制自噬流促进颗粒细胞凋亡。