小鼠卵泡不同发育阶段差异表达MicroRNA的筛选鉴定和功能研究

MicroRNA在哺乳动物卵泡发育过程中起着重要的调控作用。为了研究microRNA在小鼠卵泡发育各阶段中的表达模式、作用及调节途径，本研究从代表卵泡发育不同阶段的不同天数新生鼠卵巢提取RNA，芯片杂交筛选并验证卵泡发育各阶段差异表达的microRNA；在体外培养体系中，促进或干扰差异表达microRNA在卵泡或颗粒细胞中的表达和功能，揭示其在卵泡或颗粒细胞的作用；添加生殖激素/生长因子（或抑制其信号通路）、检测鉴定差异表达microRNA的上游调控因子，预测并鉴定调节microRNA前体基因转录的转录因子及启动子的结合位点；预测并鉴定差异表达microRNA 的靶基因,初步研究其在卵泡发育和颗粒细胞中的作用。通过研究，可以鉴定小鼠卵泡发育各阶段差异表达的microRNA及其上下游调控因子、阐明其对卵泡发育或颗粒细胞的作用和机制。研究结果将为人类生殖健康和动物遗传育种与繁殖提供理论参考。

MicroRNA在哺乳动物卵泡发育过程中发挥重要的调控作用，然而，卵泡发育过程中microRNA 的功能研究还处于初步阶段，仍然有很多科研问题等待解决。本课题以小鼠为实验动物模型，分离获得不同大小天数小鼠卵巢样品，经过深度测序获得不同样品间差异表达microRNA的表达图谱。以此为研究依据，进行如下研究：1）检测发育不同时期卵泡样品中所筛选microRNAs的表达规律；2）过表达或干扰microRNA的表达，探讨其对腔前卵泡发育和颗粒细胞生长的作用和可能的调控机制；3）颗粒细胞体外培养过程中添加促性腺激素(FSH/LH)，检测其对microRNA表达的影响；4）筛选鉴定microRNA的靶基因；5）深入研究靶基因在卵泡发育过程中的作用和调控机制。本研究获得的主要结果如下：1）分离4种发育时期卵泡，RT-PCR检测了21种microRNAs的表达。其中17种microRNAs在不同发育时期卵泡内的表达规律同深度测序结果一致，该实验结果进一步验证了深度测序结果的准确性，同时揭示了microRNAs在卵泡发育不同阶段的差异表达性。2）腔前卵泡和颗粒细胞体外培养过程中转染microRNA 模拟物或抑制物，研究发现miR-495可通过调控颗粒细胞生长和雌激素分泌来抑制腔前卵泡的体外发育；miR-485在调控颗粒细胞生长和卵泡发育方面的作用相对复杂；miR-133a和miR-381负调控颗粒细胞的生长，而miR-15a正调控颗粒细胞的生长；miR-351则可诱导颗粒细胞凋亡，对增殖没有显著性影响。3）颗粒细胞体外培养添加FSH、LH，RT-PCR检测了6种具有代表性的microRNAs表达。结果表明FSH/LH参与调控所选microRNAs在颗粒细胞内的表达，并具有时间依赖性，该结果说明促性腺激素是microRNA的上游调控因子。4）通过不同靶基因预测软件的预测和双荧光素酶报告系统实验，成功筛选并验证了3个microRNAs的靶基因，包括p53 、Chk1和SUMO-1。5）利用抑制剂AZD7762，研究发现Chk1通过调控颗粒细胞的正常生长参与调控腔前卵泡的体外发育。综上，该研究结果将为深入探讨microRNAs在调控卵泡生长和闭锁、颗粒细胞增殖和凋亡及分化过程中的作用奠定重要理论基础，将为理解哺乳动物卵泡发育、排卵和卵子成熟机制提供理论参考。