苹果花粉无机焦磷酸酶在自交不亲和反应中的作用机制研究

蔷薇科果树属配子体自交不亲和（SI），受花柱S-RNase介导。前一基金通过苹果花柱S2-RNase C2HVC3区筛选花粉cDNA文库获得的无机焦磷酸酶基因（IP）片段能与S1-、S2-RNase互作，添加自我花柱蛋白粗提物（含S-RNase）培养花粉发现花粉管IP活性降低，初步推断IP可能受控S-RNase，参与SI反应。该项目在此基础上，首先通过RACE克隆基因全长，利用体外及双分子荧光互补实验（活体）验证其与S-RNase的互作关系，进行组织特异性分析与定位；通过添加诱导有活性的S-RNase及去除S-RNase的花柱蛋白粗提物等培养花粉分析S-RNase对IP活性影响，通过寡核苷酸转染、显性抑制及转基因实验证明IP对花粉管生长影响及亲和性变化，在添加诱导有活性的S-RNase培养P32标记的花粉后证明S-RNase导致IP磷酸化是否为其失活的原因。弄清IP在SI反应中的作用机制。

S-RNase 介导的配子体自交不亲和性被认为是其引起的自我花粉管rRNA 降解导致蛋白质合成受阻所致，但其作用机制尚不够明确。本研究以苹果S2-RNase 成熟多肽区为诱饵蛋白筛选‘国光’（S1S2）花粉cDNA 文库，获得了一个与其存在强烈物理互作且在花粉中大量表达的可溶性无机焦磷酸酶基因，命名为MdPPa。基因枪瞬时转化、免疫荧光定位和原生质体瞬时转化实验证明MdPPa 蛋白定位于花粉管溶质中。重组S-RNase 蛋白体外添加培养自我花粉及寡合苷酸转染沉默花粉管内MdPPa 均能显著抑制花粉管内源无机焦磷酸酶酶活，并造成无机焦磷酸（PPi）显著积累；体外重组的S-RNase 与MdPPa 蛋白共孵育发现S-RNase 特异地抑制MdPPa 水解PPi 的活性。将MdPPa 氨基酸序列分段删减后与S-RNase 进行互作分析发现S-RNase 与MdPPa 的两个高变区存在互作，酶动力学分析显示S-RNase 通过非竞争性抑制的方式抑制MdPPa 的活性。添加自我S-RNase 及沉默MdPPa 在增加PPi 含量的同时可造成花粉管内tRNA 氨酰化过程受阻。因此，我们提出了一种自交不亲和新的S-RNase 毒性机制，即苹果花柱S-RNase 通过抑制花粉管中MdPPa 水解PPi 活性，使得PPi 积累，阻碍花粉管内tRNA 氨酰化过程，引起蛋白合成受阻，导致花粉管生长停滞，造成自交不亲和现象。