苹果花柱S-RNase调控MdMVG蛋白切割花粉管微丝的自交不亲和机制研究

Apple (Malus×domastica) shows gametophytic self-incompatibility which is due to the toxic effect of the S-RNase to the pollen tubes. But the molecular mechanism is still unclear. In this research, we obtained an unknown function protein from apple by yeast two-hybrid screening which contained actin binding domain, and named MdMVG. We used a phosphorothioated antisense oligodeoxynucleotide to down-regulate MdMVG expression in the pollen tube and then added to S-RNase. The results we found that the growth rate of pollen tube growth is slow,top cylindrical enlargement; the short actin fragment is much more than control.Co-precipitation of proteins in vitro experiment showed that MdMVG could cut actin filaments. In the view of this,firstly, we use protein interaction experiments in vivo to further verify the interaction relationship between MdMVG and S-RNase; secondly, co-precipitation experiment to demonstrate that S-RNase could promote MdMVG to cut filament; then in order to verify that S-RNase could bind with MdMVG and negative feedback regulate the cutting reaction in pollen tube, we use yeast two hybrid experiment to find the transcription factor of MdMVG; at last, we use transgenic experiment to confirm that MdMVG participate in the self-incompatibility. Finally, we could clarify that MdMVG play a role in self-incompatibility reaction by the function of S-RNase.

苹果自交不亲和是由于自花授粉后花柱S-RNase进入花粉管影响其生长所致，但其作用机制尚不明确。本课题组以S-RNase为诱饵筛选花粉cDNA文库获得一个含有微丝结合结构域的未知基因，命名为MdMVG；体外添加反义寡核苷酸链培养花粉沉默该基因后再用S-RNase处理发现花粉管生长减缓，顶端呈圆柱形膨大，与对照相比短小微丝碎片增多；蛋白质体外共沉淀实验证明MdMVG能够切割微丝。鉴于此，本研究首先利用体内外互作实验进一步验证MdMVG与S-RNase的互作关系；其次，通过S-RNase与MdMVG蛋白体外孵育后共沉淀明确S-RNase能否促进MdMVG切割微丝；再次，寻找MdMVG转录因子，证明S-RNase与MdMVG结合是否为负反馈调节调控其切割花粉管微丝；最后，MdMVG转基因验证其是否参与了自交不亲和反应。最终明确苹果花粉MdMVG蛋白在S-RNase作用下参与自交不亲和反应的机制。

苹果的自交不亲和性是其花柱与花粉间的特异性识别反应，贯穿于整个花柱对花粉的拒斥过程中。在花柱中正常生长的花粉管微丝细胞骨架一直处于动态的装配中，其装配包括微丝骨架的切割、解聚、聚合、成束等不同的装配方式。其中，微丝的切割作用可为花粉管提供大量游离的且有活性的微丝小片段，这为微丝的聚合、加帽、成束等作用提供基础。苹果S-RNase进入自我花粉管后其是否能与微丝骨架直接结合对其进行切割？如果S-RNase不能切割微丝，那么在此过程中到底是哪个切割蛋白在起作用，S-RNase对其起到怎样的调控作用。因此，本项目主要以苹果‘国光’（Malus domestica.V. Rall’s Jane, S1S2）为试材，利用多种方法证明了S-RNase在进入自我花粉管过程中通过结合一个新的微丝切割蛋白MdMVG的3个微丝切割位点而抑制其切割自我花粉管微丝，花粉管生长减慢。其主要研究结果如下：.1.授粉后花柱分泌的自我S-RNase进入花粉管中会破坏其微丝骨架从而影响生长，但其作用机制尚不明确。为了弄清S-RNase是否直接影响微丝的形态，我们分别利用体内和体外试验检测4种基因型S1-、S2-、S3-和S9-RNase与微丝的结合及切割情况。首先高速共沉淀结合试验发现S-RNase均不与微丝结合。其次免疫荧光花粉管免疫荧光发现S-RNase不与微丝共定位。.2.我们以苹果S2-RNase成熟多肽区为诱饵蛋白筛选‘国光’花粉cDNA文库，成功获得一个全长921 bp的含有微丝运动能量输出区（Myosin）、微丝切割区（Villin）、微丝结合区(GRAM)的未知基因，命名为MdMVG。微丝共沉淀和免疫荧光试验表明MdMVG能够与微丝结合并切割微丝。将4种基因型S-RNases分别与MdMVG、微丝共孵育，体外荧光标记静态及TIRFM动态观察微丝的切割程度和切割速率明显降低。MdMVG基因枪轰击花粉管后再添加自我S1-RNase+S2-RNase同样发现MdMVG切割微丝的速率减慢，花粉管生长受到抑制。.3.蛋白分段和点突变证明MdMVG切割位点为167E、171E、185K。花粉管基因枪实验表明自我S-RNase确实通过结合MdMVG的3个切割位点而抑制其切割微丝的。.综上所述，苹果花柱自我S-RNase确实通过结合MdMVG的3个微丝切割位点从影响其生长的研究。