酵母 tRNA 特异的腺苷脱氨酶的结构及生化性质研究

The tRNA-specific adenosine deaminases (ADATs or Tads) catalyze the deamination reaction of the adenosine at the first position of tRNA anticodon (A34, also known as the wobble-position), and converts adenosine to inosine (I). I34 can pair with U, C, or A in the third position of codons in mRNAs due to its unique chemical structure and alternative base-pairing pattern. Therefore a single tRNA species containing I can decode three different codons, without the needs for additional tRNA isoacceptors decoding the degenerate codons. Wobble base-pairing in this manner thus greatly improves the decoding efficiency, and prevents frameshifting during translation. Tads consist of different components in prokaryotes and eukaryotes. In eukaryotes, they consist of two subunits Tad2 and Tad3, which form heterodimers for catalysis. Knockout of yeast Tad2 and Tad3 is lethal. Additionally, studies showed that a missense mutation of V128 in Tad3 causes intellectual disability and strabismus. In this study, we aim to solve the full-length Tad2/Tad3 structure and its complex structure with substrate tRNA to understand the mechanism of substrate recognition and catalysis of the chemical reaction. Comparison of the catalytic mechanism of TadAs from prokaryotes adds to our knowledge on the A34 modification of tRNA. Meanwhile, this study also provide insight into pathogenesis of diseases such as mental retardation and strabismus on a molecular level.

tRNA 特异的腺苷脱氨酶（ADAT 或Tad）可对 tRNA 34 位（摆动位置）的腺苷进行加水脱氨，将腺苷 A 转化为肌苷 I。摆动位置的 I 能与 mRNA 密码子第三位的 A，C 或 U 配对，使单个 tRNA 有效解码相同氨基酸的三个简并的密码子，因而在蛋白的翻译过程中发挥重要作用。该酶在真核生物包含 Tad2 和 Tad3 两个亚基，以异源二聚体的形式存在，共同催化 A34 的水解脱氨。敲除酵母Tad2 和 Tad3会致死。此外，人源 Tad3 亚基上 128 位的缬氨酸突变为甲硫氨酸造成智障与斜视等多种畸形。本课题旨在解析酵母 Tad2/Tad3 全酶及其底物 tRNA 的复合物的结构，了解真核生物 Tad 蛋白识别与催化 tRNA 底物的机制。比较其与原核生物 TadA 催化机制的异同，完善我们对 tRNA I34 修饰的认知，并为研究智障与斜视等疾病成病机理提供指导。

在翻译过程中，发生于tRNA的反密码子环中A到I的编辑对于摆动碱基配对至关重要。这种修饰是通过在A34号碱基上脱氨作用产生的，由ADAT酶催化。真核生物ADAT全酶是由催化亚单位ADAT2和结构亚单位ADAT3组成的异源二聚体，但它们的分子组装和催化机制在很大程度上不清楚。在本研究中，我们解析了酵母ADAT的异源二聚体（ScADAT2/3）2.8埃的晶体结构，揭示了其装配和底物的识别机制。我们发现每个亚基都包含一个类似于它们的原核生物同源的TadA酶的结构域，这可能由基因复制事件而得来，同时它们也各自含有其它功能相关的附属结构域。ScADAT3的N端含有一个带正电的、潜在tRNA 的识别和结合的区域，该结构域的功能得到了我们的生化分析的数据支持与验证。另一方面，ScADAT3使用其C端来阻止tRNA进入其“伪活性”位点。因此，尽管ScADAT3保存了锌离子结合位点， 但底物的无法进入而使自身无法脱氨。生物信息系分析发现而此机制可能只存在于一些酵母种类中。最后，结合结构与生化、生物信息学和体内功能研究，我们提出ADAT2/3脱氨途径的分步模型。我们的工作在分子水平提供了真核生物ADAT全酶的A到I编辑的分子机制，尤其加深了人们对ADAT3在催化中的作用的理解。