双加氧酶 AlkBH1调控翻译起始 tRNA(iMet) m1A58 去甲基化的结构及生化性质研究

The modified base m1A58 is essential for the structure maintenance of tRNA(iMet). Under stress conditions, tRNA(iMet) lacking methylation on A58 is prone to degradation. AlkB family dioxygenases regulate the oxidative demethylation of nucleic acids through an iron (II)- and 2-oxoglutarate-dependent fashion. Mammalian AlkBH1s have recently been shown as tRNA demethylases that mediate the demethylation of N1-methyladenosine (m1A) in tRNAs. The AlkBH1-catalyzed demethylation on the target tRNAs results in attenuated translation initiation and decreased usage of tRNA(Met) in protein synthesis. At present, the structural basis of the substrate recognition is poorly understood. In this study, we plan to solve the structures of the AlkBH1 in the free and in the tRNA-bound form by the X-ray crystallography. In combination with in-vitro and in-vivo biochemical experiments, we seek to elucidate the biological functions of AlkBH1.

tRNA(iMet) 58 位腺苷的正常甲基化是翻译起始 tRNA 三级结构维持的必要因素，缺失 m1A58 的修饰的 tRNA(iMet) 在应激条件下易于降解。α-酮戊二酸 (2-oxoglutarate，2OG) 和 Fe2+ 依赖的双加氧酶 AlkB 家族成员蛋白以氧化去甲基化方式调控核酸的甲基化修饰。近期的研究发现哺乳动物 AlkB 家族成员 AlkBH1 是一种 tRNA 的去甲基化酶，能够调控该 tRNA m1A58 的去甲基化，引起蛋白翻译起始阻滞及延伸 tRNA(Met) 的使用率下降。目前，AlkBH1 选择性识别含有底物 tRNA 的分子机制和结构基础尚不清楚。本课题从结构生物学角度出发，结合生物化学与分子生物学技术对此进行深入的研究与探讨，从而明确其生物学意义。

tRNA(iMet)58位腺苷的正常甲基化是翻译起始tRNA三级结构维持的必要因素，缺失m1A58的修饰的tRNA(iMet)在应激条件下易于降解。α-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶AlkB家族成员蛋白以氧化去甲基化方式调控核酸的甲基化修饰。近期的研究发现哺乳动物AlkB家族成员AlkBH1是一种tRNA的去甲基化酶，能够调控该tRNA m1A58的去甲基化，引起蛋白翻译起始阻滞及延伸tRNA(Met)的使用率下降。目前，AlkBH1选择性识别含有底物tRNA的分子机制和结构基础尚不清楚。本课题从结构生物学角度出发，结合生物化学与分子生物学技术对此进行深入的研究与探讨，从而明确其生物学意义。.本课题解析了AlkBH1蛋白的结构，揭示其N端结构域与AlkB核心催化域形成密切连接，并有助于RNA底物的识别。体外证明了AlkBH1对RNA表现出良好的去甲基化催化活性；证明了Y184、H231、D233、H287、R338以及R344在AlkBH1蛋白热稳定性维持、结合辅因子和催化底物、催化活性维持等方面发挥着关键性作用。同时，以肺癌为疾病模型，研究了AlkBH1对肺癌发生发展的作用，从体内外证明了AlkBH1通过调控RNA甲基化修饰调控肺癌的发生发展。体外沉默AlkBH1基因可以抑制肺癌细胞A549的增殖、迁移、侵袭能力；体外过表达AlkBH1基因后肺癌细胞A549的增殖、迁移、侵袭能力受到显著增强。乌拉坦诱导小鼠肺癌模型的实验结果证明，小鼠肺癌组织中AlkBH1蛋白水平和基因水平均升高，表明AlkBH1在肺癌的发生发展中发挥着重要作用。同时，总之，我们的细胞、生化和结构结果相结合，有助于深入了解因此，本研究为阐明AlkBH1催化RNA去甲基化原理提供了基础，同时为寻找AlkBH1抑制剂奠定了结构基础，也为以AlkBH1为靶点治疗肺癌提供了新的思路。