LuxS/AI-2群体感应系统调控益生乳杆菌生物被膜形成的分子机制

Biofilm formation represents a protected mode of growth that allows probiotics to survive in hostile environments. Lactobacillus paraplantarum L-ZS9 is characterized by high gastrointestinal tolerance and adhesion ability, showing its great potential for application in probiotic products. Our previous studies have shown that L. paraplantarum L-ZS9 forms biofilm. Whole genome sequencing shows that L. paraplantarum L-ZS9 possesses gene luxS, a key gene involved in LuxS/AI-2 quorum sensing (QS). In addition, exogenous AI-2 and inhibitor D-ribose alter its biofilm formation, showing that LuxS/AI-2 QS may regulate biofilm formation of L. paraplantarum L-ZS9. In this project, the function of luxS and LuxS/AI-2 QS on biofilm formation of L. paraplantarum L-ZS9 will first be determined by the construction of mutant strains in combination with the use of exogenous AI-2. Genes and proteins potentially regulated by LuxS/AI-2 QS will then be identified by using RNAseq and iTRAQ. The functions of these genes will be validated through gene mutation, biofilm assay and qRT-PCR. This project aims at elucidating the molecular mechanisms by which LuxS/AI-2 QS regulates biofilm formation of Lactobacillus paraplantarum.

生物被膜是益生菌在环境胁迫中发挥生理功能的重要形式。类植物乳杆菌L-ZS9具有较高被膜形成能力及良好胃肠道耐受性与高黏附性，显示出作为益生菌制剂的潜力。全基因组测序发现，L-ZS9含有LuxS/AI-2群体感应（quorum sensing，QS）系统关键基因luxS，外源补充AI-2信号分子及其阻断剂D-ribose可明显影响被膜形成量，初步表明该系统参与了被膜的形成。本项目拟通过构建luxS缺失株、过表达株及外源补充AI-2来验证luxS功能，明确该系统对被膜的调控作用；利用RNAseq和iTRAQ技术对外源添加/不添加AI-2的luxS缺失株、过表达株及野生株进行高通量测序，在组学水平筛选差异基因/蛋白，提出被膜形成的假设性通路；进一步构建假设通路关键基因缺失株（库），通过被膜形成能力检测并结合qRT-PCR技术进行相关验证，最终从分子水平阐释QS系统调控乳杆菌生物被膜形成的机制。

生物被膜是多数细菌自然状态下的一种生长方式，有助于菌体抵抗外界环境胁迫，其形成与发展常受到群体感应（Quorum sensing, QS）系统调控。然而，目前研究多集中于病原菌，涉及益生菌的相关研究非常匮乏。.本项目以一株分离自发酵肉制品类植物乳杆菌L-ZS9为材料，通过全基因组测序证明其具有合成AI-2的关键基因luxS，且AI-2的合成通路完整，说明L-ZS9具有合成 AI-2的分子基础；报告菌株发光检测试验表明，L-ZS9具有合成和分泌AI-2的能力，且被膜态菌株可产生更高浓度的AI-2；活性抑制试验表明，D-核糖具有抑制L-ZS9 AI-2活性的能力，并可抑制其被膜形成；进一步通过2D蛋白组学鉴定出27个蛋白受到D-核糖的调控，生物信息学分析表明，D-核糖可能主要通过调节转录翻译及糖代谢产能途径对L-ZS9进行全局性调控，进而调节被膜形成。以上说明菌株L-ZS9的被膜形成与AI-2具有相关性。.过表达luxS基因可促进乳杆菌L-ZS9 AI-2的合成，且增强其被膜形成能力；RNA-seq鉴定出luxS-pMG76e-L-ZS9中有35个基因发生2倍以上差异表达，iTRAQ鉴定发现有35个蛋白发生≥1.2或≤0.83的差异表达；进一步生物信息学分析发现，luxS基因过表达主要影响转运及膜相关蛋白，表明luxS基因过表达可能是通过调节细胞膜相关蛋白及膜转运蛋白来调控菌体对胞外环境的适应及应答；此外，基因luxS过表达会影响AraC家族、LacI家族及PadR家族转录调节子的表达，以上基因与被膜形成及QS系统有关。.基于组学水平的分析和预测，进一步构建过表达重组菌，通过对QS系统假设调控基因进行验证，发现LuxS/AI-2 QS通过调控基因rpoN、guf、tuf、fba、gap、pgm、nfo、rib和sugE来调节L-ZS9的被膜形成；过表达rpoN、guf、tuf、fba、gap和pgm基因可促进菌株L-ZS9被膜形成，过表达nfo、rib和sugE则抑制被膜形成，且rpoN可能通过调控基因guf、nfo、rib和sugE的表达来调节L-ZS9的被膜形成。.本项目重点探究了LuxS/AI-2 QS系统调控益生乳杆菌生物被膜形成的途径与机制，研究结果可为AI-2通用信号分子调控肠道菌群结构及高活性被膜态益生菌制剂的开发利用提供了新的思路与理论基础。