双歧杆菌胞外多糖的结构解析及调节肠黏膜免疫机制研究

The exopolysaccharide (EPS) produced by Bifidobacterium which possesses many beneficial properties, is an important health-promoting secondary metabolite, resulting to its potentially valuable application in food industry as functional ingredients. .This project aims at laying a theoretical foundation for illustrating the stucture-activity relationships of EPS from Bifidobacterium animalis RH, isolated from the feces of Bama centenarians in Guangxi, China. In order to achieve such purpose, the methods of ethanol precipitation, anion exchange chromatography, gel permeation chromatography, HPLC, HPAEC-PAD, periodate oxidation, methylation analysis, GC-MS, NMR spectroscopy, AFM, LLS and X-ray are chosen to determinate and analyze the average molecular mass, monosaccharide composition, primary and advanced structures of EPS. Through the variation of lymphopoiesis, leukomonocyte subgroup, cytokines and antibody production between EPS group and model group induced by CTX both in vitro and in vivo, the regulatory machanism of EPS on intestinal mucosal immunity will be obtained.

胞外多糖（exopolysaccharides, EPS）是乳酸菌的重要次生代谢产物，其结构复杂功能多样，可作为功能因子应用于食品。本项目以分离自广西巴马长寿老人肠道的一株双歧杆菌为材料，采用色谱纯化技术制备纯品EPS，应用GPC、HPAEC、GC-MS、NMR、AFM、LLS、X-ray等技术手段分析测定EPS的分子量、单糖组成、连接方式、连接顺序及固体形貌、溶液性质、链构象，解析其初、高级结构特征。同时，以肠黏膜免疫相关淋巴细胞的增殖情况、淋巴细胞亚群变化、细胞因子表达量和抗体分泌量等为指标，通过体外和体内试验探明EPS作用于肠黏膜免疫细胞的位点和方式，最终从细胞和分子水平上揭示该EPS调节肠黏膜免疫功能的作用机制。研究结果不仅为后续EPS构效关系的阐明奠定了理论基础，同时也为新型食品添加剂、保健产品的开发应用提供了新的资源与途径。

胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌重要的次生代谢产物，具有多种生物活性，是一类应用前景广阔的功能性食品资源。.本项目以一株分离自长寿老人源动物双歧杆菌RH（Bifidobacterium animalis RH）为出发菌种，通过优化发酵与纯化条件，获得产量高且比例均衡的中性多糖(EPSa)和酸性多糖(EPSb)；采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析与Sepharose CL-6B凝胶柱层析色谱纯化技术，制备出高纯度的EPSa与EPSb，为多糖结构的解析奠定了基础。应用HPLC技术解析了多糖纯度及其分子量，EPSa分子量为2.31×104 Da，EPSb分子量为2.13×104 Da；红外光谱(FT-IR)分析解析了多糖特征吸收峰与主要官能团；HPAEC-PAD分析了多糖中的单糖组成成分，EPSa的单糖摩尔比约为Ara: Gal: Glc: Man = 0.4: 1.8: 4.3: 3.4，而EPSb约为Rha: Ara: Gal: Glc: Man = 0.4: 0.3: 1.6: 0.8: 1.2；高碘酸氧化、Smith降解分析糖苷键类型主要为1→ 2，1→ 2,6，1→ 4，1→ 4,6连接方式；NMR检测解析了多糖的构型主要为α构型；甲基化分析与GC-MS解析了多糖中的重复单元，采用以上技术解析了双歧杆菌RH所产胞外多糖的一级结构；采用原子力显微镜(AFM)与X-ray技术解析了多糖的高级结构及空间构型，完善了功能性多糖结构信息库。.以肠黏膜免疫相关淋巴细胞及环磷酰胺诱导肠黏膜损伤小鼠为模型，以淋巴细胞增殖、细胞因子及抗体分泌量为指标，确定了双歧杆菌EPS具有调节肠黏膜免疫功能；采用受体阻断法确定双歧杆菌EPS主要通过TLR4进行免疫应答，通过上调巨噬细胞IL-6和TNF-α mRNA的转录水平，提高趋化因子MCP-1和MIP1-α的表达量，参与免疫信号转导过程，进一步募集免疫细胞参与肠黏膜免疫调节，进而参与机体免疫。通过体内、体外试验证明了EPS作用于肠黏膜免疫系统的位点和方式，从细胞和分子水平揭示了双歧杆菌EPS调节肠黏膜免疫的作用机制。本研究从代谢产物角度为双歧杆菌益生机制的阐明提供了新的视角和理论依据，同时可为新型食品添加剂、保健食品的开发提供新的资源与途径，具有广阔的科学价值和应用前景。