番茄花叶病毒CP与烟草Fd I直接互作的分子机制研究

植物病毒侵染植物影响其光合作用，引起花叶、黄化等症状与病毒破坏植物叶绿体结构和电子传递活性有关。研究已经证实病毒的CP参与了病毒侵染过程中植物症状的表达，也明确了Fd I的不均匀表达与病毒侵染的烟草症状表达有关，但目前没有CP与Fd I直接相互作用的报道。申请者首次发现了ToMV CP与Fd I直接互作，本项目以该发现为基础，进一步利用酵母双杂交分析ToMV CP与Fd I的特异性及其作用位点，用双分子荧光互补技术分析ToMV CP与Fd I作用位点对其在植物体内相互作用的影响，并利用ToMV全长cDNA侵染性克隆分析ToMV CP与Fd I相互作用对植物光合作用和症状表达的影响，进而明确ToMV CP与Fd I相互作用分子机制及其在ToMV影响植物光合作用和症状表达中所起的作用。为CP和Fd I直接的相互作用提供证据，并为阐明植物病毒影响植物光合作用、引起症状表达的机制提供参考依据。

植物病毒侵染植物产生不同的症状是病毒与寄主相互作用的结果。番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）作为烟草花叶病毒属的成员，是单链正义RNA病毒，与模式病毒—烟草花叶病毒具有亲密的亲缘关系。ToMV可以侵染150多种双子叶草本植物，并在多种作物上引起严重的经济损失。其外壳蛋白（coat protein，CP）不但在病毒的粒子包装和运动过程中起重要的作用，并且参与了病毒侵染过程中寄主症状的形成。我们前期研究发现ToMV CP可以与叶绿体铁氧还蛋白（ferredoxin I，Fd I）直接在酵母体内相互作用。为了进一步明确ToMV CP与Fd I直接互作的分子机制，并为阐明植物病毒影响植物光合作用、引起症状表达的机制提供参考依据，我们首先利用酵母双杂交技术分析了ToMV CP与Fd I相互作用的特异性和互作区域。结果表明其为非特异性互作，Fd I不但与ToMV CP互作，还可以与黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒，烟草脆裂病毒的CP互作。ToMV CP和Fd I的最小结合域分别为ToMV CP C端含有α螺旋区的54个氨基酸及Fd I C端32个氨基酸。利用对比筛选出高效介导外源基因在植物中表达的农杆菌株EHA105，我们用双分子荧光互补技术证实ToMV CP和Fd I在烟草活体细胞中仍然可以直接互作。通过原核表达和免疫家兔制备了Fd I多克隆抗体，我们利用该抗体分析证实了Fd I在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。我们利用缺失突变的技术在ToMV侵染性克隆上缺失了CP C端含有α螺旋区的54个氨基酸，构建ToMV突变株ToMV△CP，分析ToMV CP与Fd I作用位点对植物光合作用和症状表达的影响。结果表明ToMV CP与Fd I区域的缺失使ToMV的侵染能力下降。突变株ToMV△CP侵染的普通烟叶片中Fd I蛋白含量和叶片光合作用效率低于健康对照，但高于野生型ToMV侵染的烟草中的Fd I蛋白含量和叶片光合作用效率；因此，我们研究发现并证实的ToMV CP与Fd I直接互作及其互作分子机制提示ToMV CP可能是通过与Fd I直接互作影响植物叶绿体蛋白的表达进而引起植物出现花叶症状。研究结果为理解植物病毒影响植物光合作用、引起症状表达的机制提供了一定的参考依据。