一个以S.l SYTA为中心的互作链影响番茄花叶病毒侵染致病的机制研究

Based on results of the former completed National Natural Science Foundation of China, we found and confirmed a protein-protein interaction chain based on S.l SYTA, ToMV MP/ DCL1-S.l SYTA-Fd I-ToMV CP. In this project, after we determined the sites or domains that are necessary S.l SYTA interacting DCL1 or Fd I in vivo of tomato by BiFC, we will used CRISPR/Cas system to deleted these sites or domains and obtain the sites-deletion mutation tomato lines. Combined with the S.l SYTA overexpressed tomato lines, we definite the biological function of S.l SYTA by comparing the biological and physiological characters of the transgenic lines with that of the wild type. Then, we investigate the effect of the increased or decreased interaction between S.l SYTA and DCL1 or Fd I on the biological function of DCL1/Fd I or their involved system. Next, we analyze the mechanism of the protein-protein interaction chain affecting the infection, replication and movement of ToMV. Finally, we reveal the mechanism of a protein-protein interaction chain based on S.l SYTA affecting the infection and pathogenicity of Tomato mosaic virus, which could provide us more insight into understanding the interaction mechanism between ToMV and its hosts.

在已结题基金项目研究基础上，我们发现并证实了番茄中存在一个以S.lSYTA为中心的蛋白互作链:ToMV MP/ DCL1-S.lSYTA- Fd I- ToMV CP。本项目拟在利用BiFC确定DCL1-S.l SYTA- Fd I中三个番茄蛋白互作最小位点或区域的基础上，利用CRISPR/Cas系统基因编辑靶向缺失S.lSYTA中与DCL1或Fd I互作的必需位点或区域，获得一系列番茄突变体，结合过表达S.lSYTA的转基因番茄，与野生番茄对比生物学表型与相关生理指标，明确S.lSYTA的生物学功能后，正反两方面分别分析S.lSYTA与DCL1或 Fd I加强或减弱对DCL1或 Fd I自身及参与系统功能的影响，然后分析三者互作影响病毒侵染、复制、移动的机制，最终解析以S.lSYTA为中心的互作链影响病毒侵染致病的分子机制，为更深入认识ToMV与寄主的互作机制提供新的证据。

番茄花叶病毒(ToMV)及与其有亲密血清学关系的烟草花叶病毒（TMV）均为引起番茄病毒病的主要病毒，当前依然无有效控制措施。其与寄主互作机制仍需深入研究。前期研究发现番茄SlSYTA参与调控病毒侵染并存在一个以SlSYTA为中心的蛋白互作链:ToMV MP/ DCL1-SlSYTA- Fd I- ToMV CP。本研究利用分子生物学、遗传学、转录组与代谢组测序等技术围绕SlSYTA与其互作蛋白如何响应病毒侵染展开研究。首先我们发现C2A结构域是SlSYTA与FdⅠ和DCL1互作的关键位点，而不是C2B。通过获得的RNAi syta沉默植株，遗传学证实了SlSYTA对病毒侵染的促进作用，并且发现SlSYTA也参与调控辣椒疫霉、灰霉和DC300等常见病原侵染。TRV介导沉默SlSYTA的互做蛋白FdⅠ发现其正调控植物抗TMV侵染，TRV：FdⅠ中病毒含量约为对照组的13.9倍。通过在syta沉默植株中沉默FdⅠ发现TMV侵染植物初期SlSYTA起主导作用。RT-qPCR与Western Blot实验证明SlSYTA抑制FdⅠ的核酸和蛋白水平表达，并且发现syta和FdⅠ OE植株均诱导胼胝质沉积，揭示SlSYTA与FdⅠ相互作用影响病毒侵染。同时发现SlSYTA可以抑制其互作蛋白DCL1的表达，SYTA OE18中DCL1含量仅为WT的28.55%。并且通过miRNA测序技术证明沉默SlSYTA调控miRNA的生物合成。其中miR164a-5p在syta沉默植株中被抑制表达，抑制率达到49.02%。通过茎环法沉默和瞬时表达发现miR164a-5p促进TMV浸染，表明SlSYTA可通过影响miR164a-5p的生物合成促进病毒浸染。此外通过转录组与代谢组测序技术挖掘SYTA促进病毒的分子机制，发现WRKY转录因子家族差异表达明显，并且参与植物抗病毒响应。植物鞘脂代谢同样受到沉默SlSYTA影响，且推测植物鞘氨醇的生物合成受到WRKY家族调控。我们推测SlSYTA还可能通过WRKYs调控鞘脂代谢途径响应病毒侵染。综合以上结果，本研究通过正反遗传学和分子植物病理学揭示了SlSYTA与其互作蛋白FdⅠ和DCL1影响TMV侵染的分子机制，明确了ToMV MP/ DCL1-SlSYTA- Fd I- ToMV CP互作链的生物学效应，为揭示病毒侵染机制和抗病毒调控提供了新的证据。