小麦黄花叶病毒CP变异对其与寄主蛋白互作的影响

Coat protein, the sole structural protein of potyviruses, exhibits multifunction including virus particle assembly, vector transmission, host identification, RNA replication as well as intracellular and intercellular movement. The amino acid mutation of CP results in the change of virus-host interactions, and even leads to the loss of pathogenicity. In order to explore the effects of Wheat Yellow Mosaic Virus CP mutation on its interaction with host factors, wheat cDNA library will be used to identify interacting wheat proteins through yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation. Different CP yeast expression vectors are constructed to screen interacting proteins, and the interaction between different varients of CP and host proteins will be analyzed to initially reveal the function of CP variation. The gene function is studied using VIGS system combined with homologous sequence analyses. The results will provide a theoretical basis for the screening of disease resistant breed, identification of virus pathogenicity as well as monitoring of viral resistance breakthrough strains.

CP是马铃薯Y病毒科病毒编码的唯一结构蛋白，具有包装病毒粒子，参与介体传播，病毒与寄主和介体识别，调节RNA复制，细胞间运动和系统侵染等功能。CP氨基酸序列的变异可以引起病毒与寄主互作变化，甚至导致致病性丧失。为了探索小麦黄花叶病毒CP氨基酸序列变异对其与寄主互作的影响，本项目以小麦黄花叶病毒CP和小麦为研究材料，利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补，通过构建不同变异类型的CP酵母表达载体，筛选与CP互作的小麦蛋白，分析不同氨基酸序列变异类型的CP与小麦互作蛋白种类及强弱差异，通过VIGS技术研究小麦基因的功能，结合寄主蛋白同源序列分析，以期能够初步揭示CP氨基酸序列变异与病毒致病型，以及寄主抗病能力之间关系等。从而为抗WYMV品种选育，病毒的致病性鉴定，以及病毒抗性突破株系监测提供理论基础。

本项目提取了小麦全株的总RNA，利用GATE-WAY技术将反转录得到的小麦cDNA片段定向转移到目的载体，同源重组反应后成功构建小麦cDNA文库。根据NCBI上小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）CP序列，构建了不同变异类型CP诱饵载体pGBK-CP,通过酵母双杂筛选获得了若干阳性克隆，不同变异类型的CP与小麦蛋白互作确实存在种类和强度的差异，烟台分离物CP诱饵质粒筛选到9个克隆，扬州分离物CP诱饵质粒最少，只筛选到4个克隆，驻马店分离物CP诱饵质粒筛选到6个克隆；扬州分离物CP与PEPCK互作强度明显强于其他来源的CP。构建WYMV-P1诱饵质粒，进行筛库和验证工作，共筛选到15个读码框正确的阳性克隆。Gene Ontology基因功能分为9类，包括与光合作用C循环，氨基酸代谢，蛋白质合成及翻译后修饰，RNA转录调控，信号分子，细胞分裂，生物降解，磷酸化以及未知功能蛋白等。对感染小麦黄花叶病毒后小麦的转录组进行了测序分析工作，与健康植株比较，KEGG数据库分析发现，共有28 294个unigenes参与123个代谢通路。在苯丙氨酸解氨酶合成途径、三羧酸循环、光合作用，激素信号传导，细胞自噬等通路中多个基因的差异表达，印证酵母互作筛选的结果，为揭示小麦黄花叶病毒的致病机制以及小麦的抗病机制提供理论基础。