烟草IP-L在番茄花叶病毒侵染移动过程中的作用及作用机制研究

As an elicitor responsible protein, IP-L interacted with ToMV CP and was associated with the long distence movement of ToMV. Previous studies showed that IP-L may play a crucial role in the infection of ToMV. In this study, based on the previous results of the understanding of the mechanism of the interaction between ToMV CP and IP-L in vivo and in vitro, we will analyze the co-localization IP-L ToMV CP-GFP or ToMV-GFP during the infection ofToMV in tobacco by fusing DsRed to IP-L. We will silence or over express the IP-L in tobacco by CRISPR/Cas system and plant trans genetic technology, and investigate the effects of transgenic plants on the infection and movement of ToMV. Based on the analysis of transgenic plants transcriptome, we will determined IP-L is involved in which of the signaling pathways for plant defense. Meanwhile, we are also interesting to know if the different light condition could affect IP-L expression level, which could also affect viral infection. The results will help us to understand the role of IP-L in the infection and movement of ToMV and its mechanism, which may shed light on the pathogenic mechanism of ToMV.

我们前期实验发现，IP-L作为首个与ToMV CP直接互作且与ToMV长距离移动相关的烟草激发子应答蛋白，其可能在ToMV侵染致病过程中起重要作用。本研究拟在已明确二者在酵母细胞、体外及烟草细胞互作分子机制的基础上，利用亚细胞定位技术分析IP-L与ToMV CP及ToMV在病毒侵染移动过程中的定位关系。用定点突变技术突变ToMV侵染性cDNA克隆中CP上与IP-L的互作位点，确定这些位点对病毒侵染移动的作用。利用CRISPR/Cas系统和转基因过表达技术分别获得完全沉默或过表达IP-L的烟草，分析转基因烟草对病毒侵染和长距离移动的影响。基于转基因植株的转录组分析IP-L可能参与的调控途径。实时荧光定量分析光对IP-L的调控作用及对病毒的侵染移动的影响。最终在多角度分析IP-L生物学功能的基础上明确IP-L在ToMV侵染移动过程中的作用及作用机理，为更进一步了解ToMV致病机制提供新的证据。

烟草IP-L是首个发现与ToMV CP互作的寄主蛋白，前期研究表明IP-L可能参与病毒的长距离运输，并可能影响植物光合电子传递链。为进一步明确IP-L在病毒侵染过程中的作用，本研究结合分子生物学、遗传学、细胞生物学、转录组学等技术，首先发现IP-L与ToMV CP共定位于叶绿体和细胞质，并且ToMV侵染会促进IP-L的高表达。ToMV CP同源蛋白TMV CP同样能与IP-L在体内互作，并且其互作发生于细胞质和细胞核，TMV侵染与TMV CP表达会诱导IP-L的高表达。在ToMV CP上突变掉其与IP-L互作的位点，导致二者在寄主体内不再相互作用，进而ToMV△CP 侵染7天后的本氏烟中积累△CP的积累不再引起IP-L的上调表达。构建IP-L过表达转基因本氏烟植株，但植株表现出自抑制现象，使得烟草内源IP-L表达降低。利用病毒介导的沉默与过表达技术发现沉默IP-L抑制TMV-GFP侵染，过表达IP -L促进TMV-GFP侵染，揭示IP-L作为植物负调控因子促进TMV-GFP侵染。结合酵母双杂交筛库系统与转录组测序技术，发现IP-L通过与天冬酰胺合成酶NbAS-B在细胞质与细胞核互作，NbAS-B作为植物抗病毒正调控因子，IP-L稳定并激发NbAS-B酶活性，诱导其抗病毒功能，从而激活天冬酰胺介导的抗病毒防御；IP-L与免疫开关蛋白RIN4在细胞膜互作，RIN4同样促进TMV-GFP侵染，二者协同促进病毒侵染，并激活其下游免疫防御信号；IP-L与类钙调蛋白NbCML30在细胞质互作，烟草NbCML30正调控寄主抗病毒，IP-L激发NbCML30抗病毒功能，调控钙离子免疫防御，番茄SlCML30作为植物抗病负调控因子，促进TMV-GFP与辣椒疫霉的侵染；IP-L与TLP1在叶绿体互作，调控其β-1，3葡聚糖酶活性，调节水杨酸免疫通路。利用实时荧光定量PCR技术明确IP-L的表达受不同光质、不同光强和不同光照时间诱导；通过转录组技术明确了IP-L通过调控PsbO的表达影响光合作用和病毒侵染，是病毒影响光合作用的关键蛋白。此外，研究首次发现天冬酰胺合成酶NbAS-B具有抗病毒功能，天冬酰胺具有抗病效果；免疫开关蛋白RIN4同样能调控病毒侵染；本氏烟与番茄CML30的抗病功能存在差异性。综合以上结果，本研究多角度解析了IP-L作为病毒影响寄主免疫防御的结点蛋白，与下游多个免疫