BRCA1蛋白在视网膜神经细胞中表达调控以及保护神经元的分子机制

The pathogenesis and prevention of optic nerve damage have been a hot topic in ophthalmology. BRCA1 plays a key role in development, determining stem cell and DNA repair in the central nervous system. Our previous studies demonstrated that BRCA1 was developmentally down-regulated in the retinas of mice after birth. BRCA1 is normally expressed in retinal precursor cells. Down-regulation of BRCA1 resulted in inefficiency of DNA repair and decreased cell viability. Moreover, BRCA1 could be in re-expressed in mature retinal neurocytes after the treatment of demethylation. However, there is no methylated site in BRCA1 promotor. Therefore, the mechanism of BRCA1 expression in retinal development and how it works remains unclear. Thus, one of our goals in this project is to discover the transcription factors of BRCA1 by DNA Pull-Down, Two-D page gel, MS and CHIP assay. The other is to investigate how BRCA1 promotes DNA repair and determines the characteristics of stem cell by retinal neurocytes transfected with exogenous BRCA1. This study will elucidate the molecular mechanisms of BRCA1 expression in retinal development and its function, which will provide a new theoretical basis for the prevention and treatment of diseases of the optic nerve.

视神经损伤的发生机制及其防治一直是眼科领域的研究热点。BRCA1是中枢神经发育、稳定干细胞特征以及DNA修复的关键蛋白。我们前期研究发现：视网膜发育过程中BRCA1逐渐沉默；视网膜前体细胞中BRCA1正常表达，下调该蛋白将导致细胞内DNA修复能力下降，细胞活性降低；成熟视网膜细胞经去甲基化后，BRCA1重新表达，但是，该蛋白启动子区域并没有甲基化位点；因此，BRCA1在视网膜发育中的表达调控及其作用的分子机制并不清楚。为此，本课题将在现有研究基础上，以视网膜神经节细胞为研究载体，根据BRCA1的启动子序列，采用DNA与蛋白相结合、蛋白质双向电泳、质谱分析、CHIP等技术，筛选作用于BRCA1启动子的关键转录因子；另外，通过感染外源性BRCA1，探讨BRCA1如何促进DNA修复及稳定干细胞特征。该研究将阐明视网膜发育中BRCA1表达调控的分子机制及其功能，为视神经疾病的防治提供新的理论依据。

青光眼、年龄相关性黄斑变性的发生发展与DNA损伤密切相关，DNA损伤的不断累积将导致神经细胞死亡，造成永久性的视力丧失。因此对视网膜神经细胞而言，DNA损伤修复意义重大。乳腺癌易感基因Brca1在增殖细胞的DNA损伤修复过程中起重要作用，参与多条修复通路，维持基因组稳定性。此外，在中枢神经系统发育过程中，Brca1可抑制神经前体细胞凋亡。Brca1还是调控中枢神经系统神经细胞分化的关键因子，视网膜中Brca1的表达随着视网膜的成熟逐渐下调，成年视网膜DNA损伤修复能力降低。因此，本研究着重于揭示视网膜神经细胞中Brca1的表达调控机制及其作用，目前已取得以下几方面的成果： (1) Brca1可促进视网膜神经细胞DNA损伤修复：通过去甲基化药物5-Aza-CdR或转染质粒上调 Brca1的表达，可以提高视网膜神经细胞对电离辐射损伤的耐受程度，但是与其它DNA修复蛋白没有关系。(2) 视网膜神经细胞中Brca1的表达调控机制方面：我们通过DNA亲和层析实验发现转录因子Gata3是Brca1启动子结合蛋白，并验证了Gata3可正向调控Brca1启动子活性和表达。(3) Gata3/Brca1通路的沉默有助于视网膜神经细胞分化：a. TSA下调视网膜神经前体细胞中Brca1表达，从而促进神经前体细胞分化成熟；b. 靶向沉默 Brca1或 Gata3可诱导前体细胞分化为神经元样细胞；c. Brca1和Gata3过表达抑制原代视网膜神经元轴突生长，与细胞周期相关蛋白并无影响。.因此，本课题的研究证实Brca1/Gata3通路在视网膜神经细胞分化及其保护中的作用，为视神经保护提供了新的治疗靶点。