TSP-1蛋白促进视网膜神经细胞DNA修复的分子机制

Post-mitotic neurocytes display DNA repair deficiency after damage induced by physiological or pathological factors. Promoting efficient DNA repair is of significant importance in the neuroprotection. Thrombospondin-1(TSP-1) secreted by glial cells plays a key role in neural development and neural protection. Our previous studies have demonstrated that TSP-1 could not only facilitate the survival of retinal neurons, axon outgrowth and synapse formation, but also promote the DNA repair and reduce the formation of γ-H2AX, an in situ marker of DNA breaks, in retina neurocytes. TGFβ domain in TSP-1 may be involved in this process. However, its underlying mechanism remains unclear. Herein, the present study intends to generate a rat microglia cell line contains exogenous TSP-1 by using RNAi technique and transfection the plasmid. To define the role of TSP-1 in DNA repair and the transformation of its relevance protein, qualitatively and quantitatively, the microglia cells are co-cultured with retinal ganglion cells, which contain 4 kind of DNA repair system (base excision repair, nucleotide excision repair, mismatch repair and non-homologous end joining repair), which are specific to post-mitotic neuron. The repair efficiency of different pathways are analyzed by flow cytometry assay, digestion and PCR. Moreover, point mutation technology is employed to reveal the importance of TGFβ active region of TSP-1 in retinal neural protection both in vitro and in vivo. This study will not only elucidates the molecular mechanisms of TSP-1 in protecting the retina neurocytes, but also provides new insights into the optic neuropathies therapy.

DNA修复缺陷是神经元损伤变性的明显特征，促进DNA修复对神经元保护具有重要意义。胶质细胞分泌的TSP-1是神经发育及保护的关键蛋白；我们前期研究发现：TSP-1不仅能有效促进视网膜神经细胞存活、轴突生长及突触形成，并且有助于神经细胞中DNA修复，该作用与TSP-1的TGFβ结构域有关；目前，TSP-1促进神经元DNA修复的分子机制并不清楚。 因此，本课题将采用siRNA干扰等技术，构建携带外源性TSP-1的大鼠小胶质细胞；将该小胶质细胞与含有DNA修复途径的视网膜神经节细胞共培养，通过流式细胞仪检测等技术，定性、定量证明TSP-1调节神经元内哪些DNA修复通路(碱基剪切修复、核酸剪切修复、错配修复、非同源末端链接)；并且，通过点突变技术，揭示TSP-1中 TGFβ结构域对DNA修复的重要性。该研究结果不仅揭示TSP-1促进神经元DNA修复的分子机制，而且为视神经疾病的防治提供新的靶点。

青光眼、年龄相关性黄斑变性的发生发展与DNA损伤密切相关，DNA损伤的不断累积将导致神经细胞死亡，造成永久性的视力丧失。因此，对视网膜神经细胞而言，减少DNA损伤，促进DNA稳定性，意义重大。血小板反应蛋白1（Tsp-1）是一种基质细胞蛋白，在神经保护中发挥重要作用，可以促进视网膜神经细胞的存活，但是其潜在机制尚未阐明。且Tsp-1蛋白结构复杂，目前对它发挥神经保护作用的活性区域及其分子机制并不清楚。因此，本项目旨在揭示Tsp-1对视网膜神经细胞的保护作用及其分子机制。主要研究成果包括以下4个方面：(1) 揭示Tsp-1在视网膜不同发育阶段的表达特性：选取不同发育时间节点的SD大鼠，取眼球进行冰冻切片及原代视网膜细胞，通过免疫荧光染色技术，分析在视网膜的不同发育阶段，Tsp-1在神经元和神经胶质细胞的表达特性；同时我们还分析了胚胎干细胞来源的神经元及神经胶质细胞中Tsp-1的表达特点。(2) 揭示661W细胞中Tsp-1促进DNA稳定性和细胞存活的分子机制：采用siRNA干扰技术，构建Tsp-1沉默的661W细胞；使用UV照射661W细胞，通过碱性彗星实验等技术，证明Tsp-1促进神经元的DNA稳定性和细胞存活是通过以下途径：①减少DNA单链断裂；②减少DNA双链断裂；③减少自发DNA损伤。(3) 揭示Tsp-1的TSR1s序列是促进DNA稳定性和细胞存活的关键结构域：通过点突变技术，用表达野生型和突变型Tsp-1的质粒转染661W细胞；使用UV照射661W细胞，通过Western blot等技术，证实Tsp-1中的TSR1s结构域可以通过减少661W细胞中的DNA单链断裂和双链断裂以促进DNA稳定性和细胞存活。(4) 揭示小胶质细胞分泌的Tsp-1是通过外泌体途径影响神经元的DNA稳定性：我们证实了小胶质细胞分泌的外泌体含有高浓度的Tsp-1；通过CRISPR-Cas9技术成功构建Tsp-1敲除的小胶质细胞系；并进一步分析Tsp-1敲除后外泌体形态结构的变化及运载物质的差异；后续对DNA稳定性影响的实验正在进行中。因此，本项目的研究不仅为Tsp-1介导的神经保护作用的机制研究提供了新见解，而且为视神经疾病的治疗提供了新靶点。